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유전학

Induire Hairy Roots par Agrobacterium rhizogenes-Transformation médiatisée dans le sarrasin tartarié (Fagopyrum tataricum)

Published: March 11, 2020
doi:
10.3791/60828
, , , , , , , ,
1Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Artemisinin Research Center,China Academy of Chinese Medical Sciences, 3College of Life Science,Huaibei Normal University, 4Economic Crop Research Institute Sichuan Academy of Agriculture Sciences, 5Research Center of Buckwheat Industry Technology,Guizhou Normal University

Summary

Nous décrivons une méthode d’induire des racines poilues par Agrobacterium rhizogenes-transformation négociée dans le sarrasin tartarinaire (Fagopyrum tataricum). Ceci peut être employé pour étudier des fonctions de gène et la production des métabolites secondaires dans le sarrasin de tartari, être adopté pour n’importe quelle transformation génétique, ou employé pour d’autres usines médicinales après amélioration.

Abstract

Le sarrasin tartari (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possède diverses activités biologiques et pharmacologiques parce qu’il contient d’abondantes métabolites secondaires comme les flavonoïdes, en particulier la rutine. Les rhizogenes agrobacterium ont été progressivement utilisés dans le monde entier pour induire des racines poilues dans les plantes médicinales afin d’étudier les fonctions génétiques et d’augmenter le rendement des métabolites secondaires. Dans cette étude, nous avons décrit une méthode détaillée pour générer des racines poilues A. rhizogenes-négociéesdans la tuberculose. Les cotyledons et l’axe hypocotyledonaire à 7-10 jours ont été sélectionnés comme explants et infectés par A. rhizogenes portant un vecteur binaire, qui a induit des racines poilues aventieuses qui sont apparues après 1 semaine. La transformation de racine poilue générée a été identifiée basée sur la morphologie, la sélection de résistance (kanamycine), et l’expression de gène de reporter (protéine fluorescente verte). Par la suite, les racines poilues transformées ont été auto-propagées au besoin. Pendant ce temps, un facteur de transcription de myéloblastose (MYB), FtMYB116, a été transformé en génome de la tuberculose à l’aide des racines poilues A. rhizogenespour vérifier le rôle de FtMYB116 dans la synthèse des flavonoïdes. Les résultats ont montré que l’expression des gènes liés aux flavonoïdes et le rendement des composés flavonoïdes (rutin et quercetine) étaient significativement (p-lt; 0,01) promues par FtMYB116, ce qui indique que les racines poilues À médiation de A. rhizogenespeuvent être utilisées comme un outil alternatif efficace pour étudier les fonctions génétiques et la production de métabolites secondaires. Le protocole détaillé étape par étape décrit dans cette étude pour générer des racines poilues peut être adopté pour toute transformation génétique ou d’autres plantes médicinales après ajustement.

Introduction

Le sarrasin tartari (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) est un type de dicotyledon appartenant au genre Fagopyrum et à la famille Polygonaceae1. Comme un type de médecine chinoise aliments homologues, la tuberculose a reçu un intérêt considérable en raison de sa composition chimique distinctive et diverses bioactivités contre les maladies. La tuberculose est principalement riche en glucides, protéines, vitamines et caroténoïdes ainsi que dans les polyphénols tels que les acides phénoliques et les flavonoïdes1. Diverses activités biologiques et pharmacologiques de flavonoïdes, y compris antioxydatif, antihypertenseur2, et anti-inflammatoire ainsi que les propriétés anticancéreuses et antidiabétiques, ont été démontrées3.

Agrobacterium rhizogenes est une bactérie du sol qui contribue au développement de la maladie des racines poilues dans plusieurs plantes supérieures, en particulier les dicotyledons, en infectant les sites de blessures4,5. Ce processus est initié par le transfert de l’ADN T dans le plasmide5,6 et est généralement accompagné par l’intégration et l’expression d’un gène exogène du plasmide Ri et les étapes suivantes de la génération du phénotype racinepoilue 7. A. rhizogenes– racines poilues transgéniques négociées, comme un outil puissant dans le domaine de la biotechnologie végétale, ont été les plus largement utilisés en raison de leur productivité stable et élevée et l’obtention facile dans une courte période. En outre, les racines poilues induites par A. rhizogenes se distinguent efficacement par leur développement de racine plagiotropic et la croissance très ramifiée dans un milieu sans hormones8. Ils peuvent être utilisés dans plusieurs domaines de recherche, y compris la production de semences artificielles, la recherche sur les nodules racines, et dans l’étude des interactions avec d’autres organismes tels que les champignons mycorrhiziens, les nématodes et les agents pathogènes racinaires7,9. En outre, les cultures de transformation des racines poilues ont été largement utilisées comme un système expérimental pour étudier les voies biochimiques et la signalisation chimique et pour produire des métabolites secondaires végétaux qui sont utilisés comme produits pharmaceutiques, cosmétiques et additifs alimentaires8,10. Les précieux métabolites secondaires, y compris les alcaloïdes indole, les aconites, les alcaloïdes tropanes, les terpenoïdes et les flavonoïdes, synthétisés dans des racines poilues de type sauvage ont été étudiés pendant plusieurs décennies chez de nombreuses espèces, telles que le ginsenoside dans Panax ginseng11, coumarine à Ammi majus12, et les composés phénoliques TBs en2,13.

Des racines poilues ont été produites à l’aide de rhizogenes A. chez 79 espèces végétales de 27 familles14. Par exemple, A. rhizogenes-médiaté transformation des racines poilues a été signalé dans le soja15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, et chicorée (Cichorium intybus L.) 20. La transformation des racines poilues de la tuberculose a également fait l’objet d’une enquête2. Peu de protocoles détaillés sont disponibles concernant le développement de racines poilues médiées par A. rhizogenes portant un vecteur binaire ou non. Par exemple, Sandra et coll.21 ont introduit une méthode de production de racines poilues transgéniques de pommes de terre soutenues dans les pousses de type sauvage. Les racines poilues entièrement développées pourraient être visualisées 5-6 semaines après l’injection de A. rhizogenes portant le gène de journaliste de gus dans les internodes de tige des usines de pomme de terre. Une autre étude avait également rapporté un système transgénique racine poilue induit par A. rhizogenes hébergeant le gène gusA journaliste en jute (Corchorus capsularis L.) 22. En outre, Supaart et coll.23 ont obtenu des racines poilues transgéniques de tabac utilisant1 A. rhizogenes transformés avec le vecteur d’expression pBI121 portant le gène de la synthase d’acide tétrahydrocannabinolic (THCA) pour produire THCA.

Cependant, un processus étape par étape pour une génération efficace de transformation des racines poilues, en particulier dans la tuberculose, a été relativement moins démontré. Dans cette étude, nous avons décrit un protocole détaillé utilisant A. rhizogenes portant le gène reporter (GFP), un marqueur sélectif (Kan), et un gène d’intérêt (b4, un gène identifié de notre groupe mais un gène non publié de base helix-boucle-helix (bHLH) famille) pour générer la transformation génétique de racine poilue dans la tuberculose. L’expérience a duré 5-6 semaines, de l’inoculation des graines à la génération de racines poilues, impliquant la préparation expling, l’infection, la coculturation, la sous-culture, et la propagation subséquente. En outre, A. rhizogenes contenant un plasmide binaire portant le transgénique de la tuberculose du facteur de transcription de myéloblastose 116 (FtMYB116) a été employé pour déterminer si FtMYB116 peut favoriser l’accumulation de flavonoïdes, particulièrement la rutine, dans la tuberculose au niveau génétique et métabolique par la transformation de racine poilue de la tuberculose. FtMYB116, qui est un facteur transcriptionnel induit par la lumière, régule la synthèse de la rutine dans différentes conditions de lumière5. Chalcone synthase (CHS), flavanone-3-hydroxylase (F3H), flavonoid-3′-hydroxylase (F3‘H), et flavonol synthase (FLS)24 sont des enzymes clés impliquées dans la voie métabolique de la biosynthèse de rutine. Par conséquent, cette étude démontre la surexpression de FtMYB116 dans les racines poilues de la tuberculose et l’expression de gènes enzymatiques clés ainsi que le contenu de la rutine et d’autres flavonoïdes tels que la quercétine.

Protocol

La tuberculose utilisée dans cette étude a été nommée BT18, qui provenait de la race de “JinQiao No.2” cultivée par le Centre de recherche de petits grains divers de l’Académie Shanxi des sciences agricoles. Les principales étapes de ce protocole sont illustrées dans la figure 1. REMARQUE : Utilisez rapidement la manipulation liée aux explantations et, si possible, gardez les plats Petri fermés pour éviter le flétrissement et la contamination. Sauf …

Representative Results

Agrobacterium rhizogenes- transformation des racines poilues de la tuberculose médiéeCette étude décrit le protocole étape par étape qui a été établi pour obtenir des racines poilues génétiquement transformées à l’aide de A. rhizogenes. Il a fallu environ 5-6 semaines de l’inoculation des graines tuberculeuses à la récolte des racines poilues identifiées, et certaines étapes clés sont représentées dans la figure 1 (A-H</s…

Discussion

La tuberculose a été utilisée dans plusieurs études liées aux métabolites secondaires aux niveaux génétique et métabolique1,2,5,27,28. La culture des racines poilues, comme source unique pour la production de métabolites, joue un rôle central dans l’ingénierie métabolique29 et peut être utilisée pour modifier les voies …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été soutenus par les Fonds de recherche fondamentale pour les instituts centraux de recherche sur le bien-être public ZXKT17002.

Materials

2*Taq PCR MasterMix Aidlab, China PC0901
Agar powder Solarbio Life Science, Beijing, China A8190
Applied Biosystems 2720 thermo cycler ThermoFisher Scientific, US A37834
AS Solarbio Life Science, Beijing, China A8110 Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectors ThermoFisher Scientific (invitrogen), US / pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodium Solarbio Life Science, Beijing, China C8240 Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed micro Hitachi, Japan No. 90560201
Diposable Petri-dish Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China /
DYY-6C electrophoresis apparatus Bjliuyi, Beijing China ECS002301
EASYspin Plus Plant RNA Kit Aidlab, China RN38
ELGA purelab untra bioscience ELGA LabWater, UK 82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometer biotek, US /
Gateway BP/LR reaction enzyme ThermoFisher Scientific (invitrogen), US 11789100/11791110
HYG-C multiple-function shaker Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China /
Kan Solarbio Life Science, Beijing, China K8020 Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizer Sanyo, Japan /
MS salts with vitamins Solarbio Life Science, Beijing, China M8521
NaCl Solarbio Life Science, Beijing, China S8210
Other chemicals unstated Beijing Chemical Works, China ethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meter Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China a008
Plant Genomic DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD DP305
Rifampin Solarbio Life Science, Beijing, China R8010 Diluted in DMSO, 50 mg/mL
Spectinomycin Solarbio Life Science, Beijing, China S8040 Diluted in Water, 100 mg/mL
Sucrose Solarbio Life Science, Beijing, China S8270
Trans2K DNA Marker TransGen Biotech, Beijing, China BM101-01
Tryptone Solarbio Life Science, Beijing, China LP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paper Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd /
Yeast Extract powder Solarbio Life Science, Beijing, China LP0021
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References

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