Induzieren hairy Roots von Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buchweizen (Fagopyrum tataricum)
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Induktion haariger Wurzeln von Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Transformation in Tartary Buchweizen (Fagopyrum tataricum). Dies kann verwendet werden, um Genfunktionen und die Produktion von sekundären Metaboliten in Tartary Buchweizen zu untersuchen, für jede genetische Transformation angenommen werden, oder für andere Heilpflanzen nach Verbesserung verwendet werden.
Abstract
Tartary Buchweizen (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] besitzt verschiedene biologische und pharmakologische Aktivitäten, weil es reichlich sekundäre Metaboliten wie Flavonoide enthält, insbesondere Rutin. Agrobacterium rhizogenes wurden nach und nach weltweit verwendet, um haarige Wurzeln in Heilpflanzen zu induzieren, um Genfunktionen zu untersuchen und die Ausbeute von sekundären Metaboliten zu erhöhen. In dieser Studie haben wir eine detaillierte Methode beschrieben, um A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeln bei TB zu erzeugen. Cotyledons und hypokotyledonäre Achse bei 7-10 Tagen wurden als Explanten ausgewählt und mit A. rhizogenes infiziert, die einen binären Vektor tragen, die zufällige haarige Wurzeln induzierten, die nach 1 Woche erschienen. Die erzeugte haarige Wurzeltransformation wurde anhand von Morphologie, Resistenzselektion (Kanamycin) und Reportergenexpression (grünes fluoreszierendes Protein) identifiziert. Anschließend wurden die transformierten haarigen Wurzeln nach Bedarf selbst propagiert. In der Zwischenzeit wurde ein Myeloblastose (MYB) Transkriptionsfaktor, FtMYB116, mit den A. rhizogenes-vermittelten haarigen Wurzeln in das TB-Genom umgewandelt, um die Rolle von FtMYB116 bei der Synthese von Flavonoiden zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von Flavonoid-bezogenen Genen und die Ausbeute von Flavonoid-Verbindungen (Rutin und Quercetin) signifikant (p < 0.01) von FtMYB116gefördert wurden, was darauf hindeutet, dass A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeln als wirksames alternatives Werkzeug zur Untersuchung von Genfunktionen und der Produktion von sekundären Metaboliten verwendet werden können. Das in dieser Studie beschriebene detaillierte Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Erzeugung haariger Wurzeln kann nach der Anpassung für jede genetische Transformation oder andere Heilpflanzen übernommen werden.
Introduction
Tartary Buchweizen (TB)(Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) ist eine Art von Dikotyledon aus der Gattung Fagopyrum und der Familie Polygonaceae1. Als eine Art von homologen Lebensmitteln in der chinesischen Medizin hat TB aufgrund ihrer ausgeprägten chemischen Zusammensetzung und ihrer vielfältigen Bioaktivitäten gegen Krankheiten großes Interesse erhalten. TB ist in erster Linie reich an Kohlenhydraten, Proteinen, Vitaminen und Carotinoiden sowie an Polyphenolen wie Phenolsäuren und Flavonoiden1. Verschiedene biologische und pharmakologische Aktivitäten von Flavonoiden, einschließlich antioxidative, antihypertensive2, und entzündungshemmende sowie Anti-Krebs und antidiabetische Eigenschaften wurden gezeigt3.
Agrobacterium rhizogenes ist ein Bodenbakterium, das zur Entwicklung von haarigen Wurzelerkrankungen in mehreren höheren Pflanzen, insbesondere Dikotyledonen, beiträgt, indem es Wundstellen4,5infiziert. Dieser Prozess wird durch die Übertragung der T-DNA in das wurzelinduzierende (Ri) Plasmid5,6 eingeleitet und wird häufig von der Integration und Expression eines exogenen Gens aus dem Ri-Plasmid und den nachfolgenden Schritten zur Erzeugung des haarigen Wurzelphäpusten7begleitet. A. rhizogenes-vermittelte transgene Haarwurzeln, als ein leistungsfähiges Werkzeug auf dem Gebiet der Pflanzenbiotechnologie, wurden aufgrund ihrer stabilen und hohen Produktivität und der einfachen Beschaffung in kurzer Zeit am häufigsten eingesetzt. Darüber hinaus zeichnen sich behaarte Wurzeln, die von A. rhizogenes induziert werden, effizient durch ihre plagiotrope Wurzelentwicklung und ein stark verzweigtes Wachstum in einem hormonfreien Medium8aus. Sie können in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden, einschließlich der künstlichen Samenproduktion, der Wurzelknötchenforschung und bei der Untersuchung der Wechselwirkungen mit anderen Organismen wie Mykorrhizapilzen, Nematoden und Wurzelregern7,9. Darüber hinaus wurden haarige Wurzeltransformationskulturen ausgiebig als experimentelles System verwendet, um die biochemischen Wege und chemische Signalisierung zu untersuchen und pflanzliche sekundäre Metaboliten zu produzieren, die als Pharmazeutika, Kosmetika und Lebensmittelzusatzstoffe8,10verwendet werden. Die wertvollen sekundären Metaboliten, einschließlich Indole-Alkaloide, Aconite, Tropanalkaloide, Terpenoide und Flavonoide, synthetisiert in wildartigen haarigen Wurzeln wurden seit mehreren Jahrzehnten in zahlreichen Arten untersucht, wie Ginsenosid in Panax Ginseng11, Coumarine in Ammi majus12, und Phenolverbindungen in TB2,13.
Haarige Wurzeln wurden mit A. rhizogenes in 79 Pflanzenarten aus 27 Familien14hergestellt. Zum Beispiel, A. rhizogenes-vermittelte haarige Wurzeltransformation wurde in Sojabohnen15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, und Chicorée (Cichorium intybus L.) berichtet 20. TB haarige Wurzeltransformation wurde auch untersucht2. Es gibt nur wenige detaillierte Protokolle zur Entwicklung haariger Wurzeln, die von A. rhizogenes vermittelt werden, die entweder einen binären Vektor tragen oder nicht. Zum Beispiel führten Sandra et al.21 eine Methode zur Herstellung transgener Kartoffelhaarwurzeln ein, die in Wildtrieben getragen werden. Die voll entwickelten haarigen Wurzeln konnten 5-6 Wochen nach der Injektion von A. rhizogenes visualisiert werden, die das gus-Reporter-Gen in die Stamminternoden von Kartoffelpflanzen tragen. Eine andere Studie hatte auch berichtet, dass ein transgenes haariges Wurzelsystem, das von A. rhizogenes induziert wurde, das gusA-Reportergen in Jute(Corchorus capsularis L.) beherbergte. 22. Darüber hinaus erhielten Supaart et al.23 transgene Tabakhaarwurzeln mit A. rhizogenes, die mit dem Expressionsvektor pBI121 transformiert wurden, der das Gen von1-Tetrahydrocannabinolic acid (THCA) Synthase trug, um THCA zu produzieren.
Ein Schrittweise-Prozess für eine effektive Generierung haariger Wurzeltransformation, insbesondere bei TB, wurde jedoch relativ weniger demonstriert. In dieser Studie haben wir ein detailliertes Protokoll mit A. rhizogenes beschrieben, das das Reportergen (GFP), einen selektiven Marker (Kan) und ein Gen von Interesse (b4, ein aus unserer Gruppe identifiziertes, aber unveröffentlichtes Gen aus der grundlegenden Helix-Loop-Helix (bHLH) Familie verwendet, um eine haarige Wurzelgenetische Transformation bei TB zu erzeugen. Das Experiment dauerte 5-6 Wochen, von der Inokulation von Samen bis zur Erzeugung von haarigen Wurzeln, die die Explantation, Infektion, Kokultivierung, Subkulierung und anschließende Vermehrung beinhalteten. Darüber hinaus wurde A. rhizogenes, das ein binäres Plasmid mit dem TB-Transgen des Myeloblastose-Transkriptionsfaktors 116 (FtMYB116) enthält, verwendet, um festzustellen, ob FtMYB116 die Ansammlung von Flavonoiden, insbesondere Rutin, bei TB auf Gen- und Metabolzenebene durch die haarige TB-Wurzeltransformation fördern kann. FtMYB116, ein lichtinduzierter Transkriptionsfaktor, reguliert die Synthese von Rutin unter verschiedenen Lichtbedingungen5. Chalcone-Synthase (CHS), Flavanon-3-Hydroxylase (F3H), Flavonoid-3′-Hydroxylase (F3‘H), und Flavonol-Synthase (FLS)24 sind Schlüsselenzyme, die am Stoffwechselweg der Rutin-Biosynthese beteiligt sind. Daher zeigt diese Studie die Überexpression von FtMYB116 bei TB haarigen Wurzeln und die Expression von wichtigen Enzymgenen sowie den Gehalt an Rutin und anderen Flavonoiden wie Quercetin.
Protocol
Representative Results
Discussion
TB wurde in mehreren Studien im Zusammenhang mit sekundären Metaboliten auf genetischen und metabolischen Ebenen1,2,5,27,28verwendet. Haarige Wurzelkultur, als eine einzigartige Quelle für die Metabolitenproduktion, spielt eine zentrale Rolle in metabolischen Engineering29 und kann verwendet werden, um Stoffwechselwege durch Einfügen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den Grundlagenforschungsfonds der zentralen öffentlichen Wohlfahrtsforschungsinstitute ZXKT17002 unterstützt.
Materials
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
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