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Indindo Raízes Peludas por Agrobacterium rhizogenes-Transformação Mediada em Trigo-Buck Tartary(Fagopyrum tataricum)

Published: March 11, 2020
doi:
10.3791/60828
, , , , , , , ,
1Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Artemisinin Research Center,China Academy of Chinese Medical Sciences, 3College of Life Science,Huaibei Normal University, 4Economic Crop Research Institute Sichuan Academy of Agriculture Sciences, 5Research Center of Buckwheat Industry Technology,Guizhou Normal University

Summary

Descrevemos um método de indução de raízes peludas pela transformação mediada pelo Agrobacterium rhizogenesno trigo-sarraceno tartary(Fagopyrum tataricum). Isso pode ser usado para investigar funções genéticas e produção de metabólitos secundários em trigo sarraceno tartary, ser adotado para qualquer transformação genética, ou usado para outras plantas medicinais após a melhoria.

Abstract

O trigo-sarraceno tartary (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possui várias atividades biológicas e farmacológicas porque contém metabólitos secundários abundantes, como flavonoides, especialmente rutina. Os rizógeness agrobacterium têm sido gradualmente usados em todo o mundo para induzir raízes peludas em plantas medicinais para investigar funções genéticas e aumentar o rendimento de metabólitos secundários. Neste estudo, descrevemos um método detalhado para gerar raízes peludas mediadas por A. Rhizogenesna TB. Cotyledons e eixo hipocotyledonary em 7-10 dias foram selecionados como explants e infectados com A. rizogenes carregando um vetor binário, que induziu raízes peludas aveniosas que apareceram após 1 semana. A transformação da raiz peluda gerada foi identificada com base na morfologia, seleção de resistência (kanamicina) e expressão genética de repórter (proteína fluorescente verde). Posteriormente, as raízes peludas transformadas foram auto-propagadas conforme necessário. Enquanto isso, um fator de transcrição da mieloblastose (MYB), FtMYB116, foi transformado no genoma da TB usando as raízes peludas mediadas por A. rhizogenespara verificar o papel do FtMYB116 na sintetização dos flavonoides. Os resultados mostraram que a expressão de genes flavonoides e o rendimento de compostos flavonoides (rutina e quercetina) foram significativamente (p < 0,01) promovidos por FtMYB116, indicando que as raízes peludas mediadas por A. rhizogenespodem ser usadas como uma ferramenta alternativa eficaz para investigar as funções genéticas e a produção de metabólitos secundários. O protocolo detalhado passo a passo descrito neste estudo para a geração de raízes peludas pode ser adotado para qualquer transformação genética ou outras plantas medicinais após o ajuste.

Introduction

O trigo-sarraceno tartary (TB)(L.) Gaertn é um tipo de dicotyledon pertencente ao gênero Fagopyrum e à família Polygonaceae1. Como um tipo de alimento homólogo da medicina chinesa, a TB vem recebendo considerável interesse devido à sua composição química distinta e às diversas bioatividades contra doenças. A TB é principalmente rica em carboidratos, proteínas, vitaminas e carotenóides, bem como em polifenóis como ácidos fenólicos e flavonoides1. Várias atividades biológicas e farmacológicas de flavonoides, incluindo antioxidativo, anti-hipertensivo2, e anti-inflamatório, bem como propriedades anticancerígenas e antidiabéticas, foram demonstradas3.

Agrobacterium rhizogenes é uma bactéria do solo que contribui para o desenvolvimento de doenças radiculares peludas em várias plantas superiores, especialmente dicotyledons, infectando locais de feridas4,5. Este processo é iniciado pela transferência do T-DNA no plasmídeo 55,6 e é comumente acompanhado pela integração e expressão de um gene exógeno do plasmídeo Ri e os passos subsequentes de geração do fenótipo da raiz peluda7. A. rhizogenes-mediadas raízes transgênicas peludas, como uma poderosa ferramenta no campo da biotecnologia vegetal, têm sido mais amplamente utilizadas devido à sua estabilidade e alta produtividade e fácil obtenção em um curto período de tempo. Além disso, as raízes peludas induzidas por A. rizógenes são eficientemente distinguidas pelo seu desenvolvimento de raiz plagiota e crescimento altamente ramificado em um meio livre dehormônios 8. Eles podem ser usados em diversos campos de pesquisa, incluindo produção de sementes artificiais, pesquisa de nódulos radiculares e no estudo das interações com outros organismos, como fungos micorrízicos, nematóides e patógenos radiculares7,9. Além disso, culturas de transformação de raízes peludas têm sido amplamente utilizadas como um sistema experimental para investigar as vias bioquímicas e a sinalização química e produzir metabólitos secundários vegetais que são usados como fármacos, cosméticos e aditivos alimentares8,10. Os valiosos metabólitos secundários, incluindo alcalóides indobes, aconitos, alcalóides tropanos, terpenóides e flavonoides, sintetizados em raízes peludas do tipo selvagem têm sido investigados por várias décadas em inúmeras espécies, como ginsenoside em Panax ginseng11, coumarine em Ammi majus12, e compostos fenólicos na TB2,13.

Raízes peludas foram produzidas usando A. rizogenes em 79 espécies de plantas de 27 famílias14. Por exemplo, a transformação da raiz peluda mediada por A. rhizogenesfoi relatada na soja15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, e chicória(Cichorium intybus L.) 20. A transformação das raízes peludas da TB também foi investigada2. Poucos protocolos detalhados estão disponíveis em relação ao desenvolvimento de raízes peludas mediadas por A. rhizogenes ou carregando um vetor binário ou não. Por exemplo, Sandra et al.21 introduziram um método de produção de raízes transgênicas de batata peluda sustentadas em brotos do tipo selvagem. As raízes peludas totalmente desenvolvidas poderiam ser visualizadas 5-6 semanas após a injeção de A. rhizogenes carregando o gene gus reporter para o caule internode plantas de batata. Outro estudo também havia relatado um sistema de raiz peluda transgênica induzido por A. rhizogenes que abrigava o gene do repórter gusA na juta(Corchorus capsularis L.) 22. Além disso, Supaart et al.23 obtiveram raízes transgênicas de tabaco peludo usando A. rhizogenes transformados com a expressão vetorial pBI121 carregando o gene de Δ1-tetrahidrocanabinolic acid (THCA) para produzir THCA.

No entanto, um processo passo a passo para uma geração eficaz de transformação de raízes peludas, especialmente na TB, tem sido relativamente menos demonstrado. Neste estudo, descrevemos um protocolo detalhado usando A. rhizogenes carregando o gene do repórter(GFP),um marcador seletivo(Kan),e um gene de interesse(b4,um gene identificado do nosso grupo, mas um gene inédito da família hélice-loop-hélice básica (bHLH)para gerar transformação genética de raiz peluda na TB. O experimento durou de 5 a 6 semanas, desde a inoculação das sementes até a geração de raízes peludas, envolvendo a preparação explante, infecção, coculturing, subcultura e posterior propagação. Além disso, A. rizogenes contendo um plasmídeo binário que transporta o transgene de TB do fator de transcrição da mieloblastose 116 (FtMYB116) foi usado para determinar se ftMYB116 pode promover o acúmulo de flavonoides, particularmente rutina, em TB no nível genético e metabólico através da transformação da raiz peluda da TB. FtMYB116, que é um fator transcricional induzido pela luz, regula a síntese de rutin em diferentes condições de luz5. Calcone synthase(CHS),flavanone-3-hydroxylase(F3H),flavonoide-3′-hydroxylase(F3‘H),e flavonol synthase(FLS)24 são enzimas-chave envolvidas na via metabólica da biossíntese rutina. Portanto, este estudo demonstra a superexpressão de FtMYB116 em raízes peludas da TB e a expressão de genes enzimáticos chave, bem como o conteúdo de rutin e outros flavonoides como a quercetina.

Protocol

A TB utilizada neste estudo foi nomeada como BT18, que se originou da raça “JinQiao No.2” cultivada pelo Centro de Pesquisa de Pequenos Grãos Diversos da Academia shanxi de Ciências Agrícolas. Os passos primários deste protocolo são ilustrados na Figura 1. NOTA: Opere rapidamente a manipulação relacionada às plantas e, quando possível, mantenha as placas de Petri fechadas para evitar murchas e contaminação. Salvo disposição em contrário, todas as in…

Representative Results

Agrobacterium rhizogenes-transformação de raiz peluda da TB mediadaEste estudo descreve o protocolo passo-a-passo que foi estabelecido para obter raízes peludas geneticamente transformadas usando A. rhizogenes. Levou aproximadamente 5-6 semanas desde a inoculação das sementes de TB até a colheita das raízes peludas identificadas, e alguns passos-chave são retratados na Figura 1 (A-H). Resumidamente, as sementes com casca esteril…

Discussion

A TB tem sido utilizada em diversos estudos relacionados a metabólitos secundários em níveis genéticos e metabólicos1,2,5,27,28. A cultura raiz peluda, como fonte única de produção metabólica, desempenha um papel fundamental na engenharia metabólica29 e pode ser usada para alterar vias metabólicas inserindo os genes relaciona…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelos Fundos de Pesquisa Fundamentais para os institutos centrais de pesquisa de bem-estar público ZXKT17002.

Materials

2*Taq PCR MasterMix Aidlab, China PC0901
Agar powder Solarbio Life Science, Beijing, China A8190
Applied Biosystems 2720 thermo cycler ThermoFisher Scientific, US A37834
AS Solarbio Life Science, Beijing, China A8110 Diluted in DMSO, 100 mM
binary vectors ThermoFisher Scientific (invitrogen), US / pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime,sodium Solarbio Life Science, Beijing, China C8240 Diluted in Water, 200 mg/mL
CF15RXII high-speed micro Hitachi, Japan No. 90560201
Diposable Petri-dish Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China /
DYY-6C electrophoresis apparatus Bjliuyi, Beijing China ECS002301
EASYspin Plus Plant RNA Kit Aidlab, China RN38
ELGA purelab untra bioscience ELGA LabWater, UK 82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometer biotek, US /
Gateway BP/LR reaction enzyme ThermoFisher Scientific (invitrogen), US 11789100/11791110
HYG-C multiple-function shaker Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China /
Kan Solarbio Life Science, Beijing, China K8020 Diluted in Water, 100 mg/mL
MLS-3750 Autoclave sterilizer Sanyo, Japan /
MS salts with vitamins Solarbio Life Science, Beijing, China M8521
NaCl Solarbio Life Science, Beijing, China S8210
Other chemicals unstated Beijing Chemical Works, China ethanol, mercury bichloride, etc.
PHS-3C pH meter Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China a008
Plant Genomic DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD DP305
Rifampin Solarbio Life Science, Beijing, China R8010 Diluted in DMSO, 50 mg/mL
Spectinomycin Solarbio Life Science, Beijing, China S8040 Diluted in Water, 100 mg/mL
Sucrose Solarbio Life Science, Beijing, China S8270
Trans2K DNA Marker TransGen Biotech, Beijing, China BM101-01
Tryptone Solarbio Life Science, Beijing, China LP0042
Whatman diameter 9 cm Filter paper Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd /
Yeast Extract powder Solarbio Life Science, Beijing, China LP0021
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Mi, Y., Zhu, Z., Qian, G., Li, Y., Meng, X., Xue, J., Chen, Q., Sun, W., Shi, Y. Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum). J. Vis. Exp. (157), e60828, doi:10.3791/60828 (2020).
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