Inducera Hairy Roots av Agrobacterium rhizogenes-medierad transformation i tartary bovete (Fagopyrum tataricum)
Summary
Vi beskriver en metod för att inducera håriga rötter av Agrobacterium rhizogenes-medieradomvandling i Tartary bovete (Fagopyrum tataricum). Detta kan användas för att undersöka genfunktioner och produktion av sekundära metaboliter i Tartary bovete, antas för någon genetisk omvandling, eller användas för andra medicinalväxter efter förbättring.
Abstract
Tartary bovete (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] har olika biologiska och farmakologiska aktiviteter eftersom den innehåller rikliga sekundära metaboliter såsom flavonoider, särskilt rutin. Agrobacterium rhizogenes har gradvis använts över hela världen för att inducera håriga rötter i medicinalväxter för att undersöka genfunktioner och öka avkastningen av sekundära metaboliter. I denna studie har vi beskrivit en detaljerad metod för att generera A. rhizogenes-medierad håriga rötter i TB. Cotyledons och hypocotyledonary axel på 7-10 dagar valdes som explants och infekterade med A. rhizogenes bär en binär vektor, som inducerade oavsiktliga håriga rötter som dök upp efter 1 vecka. Den genererade håriga rotomvandlingen identifierades baserat på morfologi, resistensval (kanamycin) och reportergenuttryck (grönt fluorescerande protein). Därefter var de förvandlade håriga rötterna självförökade efter behov. Under tiden förvandlades en myeloblastos (MYB) transkriptionsfaktor, FtMYB116, till TB-genomet med hjälp av A. rhizogenes-medieradehåriga rötter för att verifiera ftMYB116s roll i syntetiserande flavonoider. Resultaten visade att uttrycket av flavonoid-relaterade gener och avkastningen av flavonoidföreningar (rutin och quercetin) var betydligt (p < 0,01) främjas av FtMYB116, vilket tyder på att A. rhizogenes-medieradhåriga rötter kan användas som ett effektivt alternativt verktyg för att undersöka genfunktioner och produktion av sekundära metaboliter. Det detaljerade steg-för-steg-protokollet som beskrivs i denna studie för att generera håriga rötter kan antas för all genetisk omvandling eller andra medicinalväxter efter justering.
Introduction
Tartary bovete (TB) (Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn) är en typ av dicotyledon som tillhör släktet Fagopyrum och familjen Polygonaceae1. Som en typ av kinesisk medicin homolog mat, tb har fått stort intresse på grund av dess särskiljande kemisk sammansättning och olika bioaktiviteter mot sjukdomar. TB är främst rik på kolhydrater, proteiner, vitaminer och karotenoider samt i polyfenoler såsom fenoler och flavonoider1. Olika biologiska och farmakologiska aktiviteter av flavonoider, inklusive antioxidativa, blodtryckssänkande2, och antiinflammatoriska samt anticancer och antidiabetiska egenskaper, har visats3.
Agrobacterium rhizogenes är en jordbakterie som bidrar till utvecklingen av hårig rotsjukdom i flera högre växter, särskilt dicotyledons, genom att infektera sårplatser4,5. Denna process initieras av överföringen av T-DNA i rotinducerande (Ri) plasmid5,6 och åtföljs ofta av integration och uttryck av en exogen gen från Ri plasmid och de efterföljande stegen för att generera hårig rot fenotyp7. A. rhizogenes-medieradetransgena hårrötter, som ett kraftfullt verktyg inom växtbioteknik, har använts mest på grund av deras stabila och höga produktivitet och enkel ervisande på kort tid. Dessutom är håriga rötter framkallas av A. rhizogenes effektivt kännetecknas av deras plagiotropa rotutveckling och mycket förgrening tillväxt i ett hormonfritt medium8. De kan användas inom flera forskningsområden, inklusive artificiell utsädeproduktion, rothärdforskning och för att studera interaktioner med andra organismer som mykorrhizalsvampar, nematoder och rotpatogener7,9. Dessutom har håriga rotomvandlingskulturer använts i stor utsträckning som ett experimentellt system för att undersöka de biokemiska vägarna och kemisk signalering och för att producera växtsekundära metaboliter som används som läkemedel, kosmetika och livsmedelstillsatser8,10. De värdefulla sekundära metaboliterna, inklusive indole alkaloider, akoniter, tropane alkaloider, terpenoider och flavonoider, syntetiserade i vildtyp håriga rötter har undersökts i flera decennier i många arter, såsom ginsenoside i Panax ginseng11, coumarine i Ammi majus12, och fenolic föreningar i TB2,13.
Håriga rötter har producerats med A. rhizogenes i 79 växtarter från 27 familjer14. Till exempel, A. rhizogenes-medieradhårig rot omvandling har rapporterats i sojaböna15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, och cikoria (Cichorium intybus L.) 20.TB hårig rotomvandling har också undersökts2. Få detaljerade protokoll finns tillgängliga om utvecklingen av håriga rötter medierad av A. rhizogenes antingen bär en binär vektor eller inte. Till exempel införde Sandra et al.21 en metod för att producera transgena potatis håriga rötter i vilda skott. De fullt utvecklade håriga rötterna kan visualiseras 5-6 veckor efter injektionen av A. rhizogenes som transporterar gus reportergenen i stammen internoder av potatisväxter. En annan studie hade också rapporterat en transgena hårig rotsystem framkallas av A. rhizogenes hysa gusA reporter genen i jute (Corchorus capsularis L.) 22.Dessutom erhöll Supaart et al.23 transgena tobakshåriga rötter med hjälp av A. rhizogenes omvandlas med uttrycksvektorn pBI121 som transporterar genen av Δ 1-tetrahydrocannabinolic acid (THCA) syntas för att producera THCA.1
En steg-för-steg-process för en effektiv generation av hårig rotomvandling, särskilt i tuberkulos, har dock varit relativt mindre påvisad. I denna studie har vi beskrivit ett detaljerat protokoll med Hjälp av A. rhizogenes som bär reportergenen (GFP),en selektiv markör (Kan), och en gen av intresse (b4, en identifierad från vår grupp men opublicerad gen från grundläggande helix-loop-helix(bHLH)familj) för att generera hårig rotgenetisk omvandling i tb. Experimentet varade i 5-6 veckor, från inokulering av frön till generering av håriga rötter, med explant beredning, infektion, kokulering, subculturing, och efterföljande förökning. Dessutom användes A. rhizogenes som innehåller en binär plasmid som transporterar tb-transgenen av myeloblastostranskriptionsfaktor 116 (FtMYB116) för att avgöra om FtMYB116 kan främja ackumulering av flavonoider, särskilt rutin, i tbc på gen- och metabolisk nivå genom TB hårig rotomvandling. FtMYB116, som är en ljusinducerad transkriptionsfaktor, reglerar syntesen av rutin under olika ljusförhållanden5. Chalcone syntas (CHS),flavanone-3-hydroxylase (F3H), flavonoid-3′-hydroxylase (F3‘H), och flavonol syntas (FLS)24 är viktiga enzymer som är involverade i den metaboliska vägen för rutin biosyntes. Därför visar denna studie överuttryck av FtMYB116 i TB håriga rötter och uttryck för viktiga enzymgener samt innehållet i rutin och andra flavonoider såsom quercetin.
Protocol
Representative Results
Discussion
TBC har använts i flera studier relaterade till sekundära metaboliter vid genetiska och metaboliska nivåer1,2,,5,27,28. Hårig rotkultur, som en unik källa för metabolitproduktion, spelar en central roll i metabolisk teknik29 och kan användas för att förändra metaboliska vägar genom att infoga relaterade gener. Kim et al.<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av fonderna för grundforskning för de centrala offentliga välfärdsforskningsinstituten ZXKT17002.
Materials
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
References
- Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
- Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
- Chilton, M. -. D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
- Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
- Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
- Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
- Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
- Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
- Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
- Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, 47-60 (2005).
- Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
- Pistelli, L., et al. . Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , (2010).
- Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
- Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
- Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
- Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
- Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
- Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
- Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
- Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. 공학. 5 (5), 907-915 (2019).
- Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
- Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
- Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
- Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
- Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
- Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
- Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
- Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
- Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
- Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
- Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
- Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
- Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
- Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
