Method Article

아그로박테리움 뿌리줄기에의한 털이 많은 뿌리 유도 -타르타르 메밀의 매개 변형(파고피룸 타타리쿰)

DOI:

10.3791/60828

⸱

March 11th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Artemisinin Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, 3College of Life Science, Huaibei Normal University, 4Economic Crop Research Institute Sichuan Academy of Agriculture Sciences, 5Research Center of Buckwheat Industry Technology, Guizhou Normal University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 아그로박테리움 뿌리줄기유전자-타르타르메밀(Fagopyrum tataricum)에서매개 변형된 변종에 의해 털이 많은 뿌리를 유도하는 방법을 설명합니다. 이 유전자 기능 및 타르타리 메밀에서 이차 대사 산물의 생산을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다., 어떤 유전 변환에 대 한 채택, 또는 개선 후 다른 약용 식물에 대 한 사용.

Abstract

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타르타리 메밀 (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] 그것은 플라보노이드, 특히 루틴과 같은 풍부한 이차 대사 산물을 포함하기 때문에 다양한 생물학적 및 약리학적 활동을 가지고 있습니다. Agrobacterium 뿌리 줄기 유전자 유전자 기능을 조사 하 고 이차 대사 산물의 수율을 증가 하는 약용 식물에 털이 뿌리를 유도 하기 위해 전세계적으로 점차적으로 사용 되었습니다. 본 연구에서, 우리는 결핵에서 A. 근위축성-매개털뿌리를 생성하는 상세한 방법을 기술하였다. 7-10일 에서 코틸레톤 및 hypocotyledonary 축은 이식으로 선택되고 1 주 후에 나타난 모험적인 털이 뿌리를 유도하는 이진 벡터를 운반하는 A. 뿌리 줄기 유전자에 감염되었습니다. 생성된 털이 많은 뿌리 형질전환은 형태, 저항성 선택(kanamycin), 및 리포터 유전자 발현(녹색 형광 단백질)에 기초하여 확인되었다. 그 후, 변형 된 털이 뿌리는 필요에 따라 자기 전파되었다. 한편, 골수모세포증(MYB) 전사 인자 인, FtMYB116은 A. 뿌리줄기-매개된 털뿌리를 이용하여 결핵 게놈으로 변형되어 플라보노이드합성에서 FtMYB116의 역할을 검증하였다. 결과는 플라보노이드 관련 유전자의 발현 및 플라보노이드 화합물(루틴 및 케르세틴)의 수율이 FtMYB116에의해 촉진된 유의한(p&0.01)이었으며, 이는 A. rhizogenes-매개털이 뿌리가 유전자 기능 및 이차 대사 산물의 생산을 조사하는 효과적인 대체 도구로 사용될 수 있음을 나타낸다. 털이 많은 뿌리를 생성하기 위한 본 연구에서 기술된 상세한 단계별 프로토콜은 조정 후 임의의 유전적 변형 또는 다른 약용 식물에 대해 채택될 수 있다.

Introduction

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타르타리 메밀(TB)(파고피룸타타리쿰(L.) 가에르트른)은 파고피룸 속과 가족다각과1에속하는 디코틸레돈의 일종이다. 한의학 상동성 식품의 일종으로, 결핵은 독특한 화학 성분과 질병에 대한 다양한 생체 활동으로 인해 상당한 관심을 받고 있습니다. 결핵은 주로 탄수화물, 단백질, 비타민 및 카로티노이드뿐만 아니라 페놀산 및 플라보노이드와 같은 폴리페놀이 풍부합니다1. 항산화,항고혈압제 2,항염증제, 항암 및 항당뇨 특성을 포함한 플라보노이드의 다양한 생물학적 및 약리학적 활동이3가지입증되었다.

아그로박테리움 뿌리줄기는 상처부위4,,5를감염시킴으로써 여러 고식물, 특히 디코틸레톤에서 털이 많은 뿌리질환의 발병에 기여하는 토양 세균이다. 이러한 과정은 뿌리 유도(Ri) 플라스미드5,,6에서 T-DNA의 전달에 의해 개시되고 일....

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Protocol

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이 연구에 사용된 결핵은 BT18로 명명되었으며, 이는 산시 농업 과학 아카데미의 소규모 기타 곡물 연구 센터에서 재배한 "JinQiao No.2"의 품종에서 유래되었습니다. 이 프로토콜의 기본 단계는 그림 1에나와 있습니다.

참고: 이식 과 관련된 조작을 신속하게 운영하고 가능하면 페트리 접시를 닫아 서 시동및 오염을 피하십시오. 달리 명시되지 않는 한, 모든 배양 배양은 25°C에서 14-h 빛 및 10-h 어두운 광주기의 조건하에서 수행되었다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 이식- 또는 박테리아 관련 작업은 층류 후드의 무균 조건하에서 수행되었다. A. 뿌리줄기 유전자 및 시험관 내 식물 배양에 대한 모든 배지 성분은 표 1에제공된다. pH를 조정한 후, 모든 배지를 20분 동안 120°C에서 오토클레이브하였다.

주의: 모든 유전자 변형 박테리아와 식물을 적절한 폐기물 용기에 보관하십시오. 모든 유해 화학물질을 연기 찬장에 넣고 유해 폐기물 용기에 보관하십시오.

1. 결핵 이식의 준비

  1. 결핵 씨앗의 준비
    1. 2년 ....

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Results

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아그로박테리움 뿌리줄기-매개 결핵 털뿌리 형질전환
본 연구는 A. 뿌리줄기유전자를사용하여 유전적으로 변형된 털뿌리를 얻기 위해 설립된 단계별 프로토콜을 설명한다. 결핵 종자의 접종으로부터 확인된 털이 많은 뿌리를 수확하는 데 약 5-6주가 걸렸으며, 몇 가지 주요 단계는 그림1(A-H)에도시되어 있습니다. Figure 1 간단히, 멸균된 껍질을 벗긴 종자(도1B)를접종하여 더 빠른 멸균 발아를 달성하였다. A. 뿌리 줄기 (그림 1D)및 멸균 이식은 각각 활성화및 사전에 준비되어야한다. 이는 활성화된 A. 뿌리줄기유전자(도 1

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Discussion

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결핵은 유전 및 대사 수준1,,2,5,27,,28에서이차 대사 산물과 관련된 여러 연구에서 사용되어 왔다.5, 털이 많은 뿌리 문화는 대사 산물 생산을위한 고유 한 공급원으로, 대사 공학(29)에 중추적 인 역할을하고 관련 유전자를 삽입하여 신진 대사 경로를 변경하는 데 사용할 수 있습니다. Kim등.2는 처음에 페놀 화합물의 생산을 달성하기 위해 A. 근성-매개형질전환에 의한 결핵 뿌리 배양물의 확립을 도입했다. 결핵털뿌리에서 얻은 루틴의 함량은 야생형 뿌리보다 10배 이상 높았다. 본 연구에서, FtMYB16의 도입은 루.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 중앙 공공 복지 연구 기관 ZXKT17002에 대한 기본 연구 기금에 의해 지원되었다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2*Taq PCR MasterMixAidlab, ChinaPC0901
한천 분말Solarbio Life Science, 베이징, 중국A8190
Applied Biosystems 2720 thermo cyclerThermoFisher Scientific, USA37834
ASSolarbio Life Science, Beijing, ChinaA8110DMSO로 희석, 100mM
binary vectorsThermoFisher 과학적(비현실적), 미국/pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)
Cefotaxime, sodiumSolarbio Life Science, 베이징, 중국C8240물에 희석, 200mg/mL
CF15RXII 고속 마이크로히타치, 일본No. 90560201
Diposable Petri-dishGuanghua 의료 기기 공장, 양저우, 중국/
DYY-6C 전기영동 장치Bjliuyi, 베이징중국 ECS002301
EASYspin Plus Plant RNA KitAidlab, 중국RN38
ELGA purelab untra 생명과학ELGA LabWater, UK82665JK1819
Epoch Microplate Spectrophotometerbiotek, 미국/
Gateway BP/LR 반응 효소ThermoFisher Scientific(invitrogen), 미국11789100/11791110
HYG-C 다기능 셰이커쑤저우 Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. 중국/
KanSolarbio Life Science, 베이징, 중국K8020물에 희석, 100 mg/mL
MLS-3750 오토클레이브 살균기Sanyo, Japan/
비타민이 함유된 MS 염Solarbio Life Science, 베이징, 중국M8521
NaClSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8210
기타 화학 물질 미명시Beijing Chemical Works, 중국에탄올, 중염화수은 등
PHS-3C pH 측정기Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, 중국a008
식물 게놈 DNA 키트TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTDDP305
RifampinSolarbio Life Science, 베이징, 중국R8010DMSO에 희석, 50 mg/mL
스펙티노마이신Solarbio Life Science, 베이징, 중국S8040물에 희석, 100 mg/mL
SucroseSolarbio Life Science, Beijing, ChinaS8270
Trans2K DNA MarkerTransGen Biotech, Beijing, ChinaBM101-01
TryptoneSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0042
Whatman 직경 9cm 여과지Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd/
Yeast Extract powderSolarbio Life Science, Beijing, ChinaLP0021
,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
  2. Kim, Y. K., et al.

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Hairy Root InductionAgrobacterium RhizogenesTartary BuckwheatFtMYB116 TransformationFlavonoid BiosynthesisRutin Quercetin AnalysisGenetic TransformationReporter Gene ExpressionSecondary Metabolite YieldPlant Tissue Culture

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