이 프로토콜은 RNA 및 단백질 생산 합성 세포의 상향식 준비를 위한 방법, 물질, 장비 및 단계를 설명합니다. 합성 세포의 내부 수성 구획은 지질 이중층(즉, 안정한 리포솜) 내에 캡슐화된 S30 세균 용해물을 함유하고, 수중 오일 에멀젼 전달 방법을 사용하였다.
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방법 논문
세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다.
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
합성 세포의 건설을위한 상향식 조립 방법은 세포를 모방 한 환경에서 세포 과정을 격리하고 조사하기위한 효과적인 도구입니다. 더욱이, 세포 없는 발현 시스템의 발달은 합성 생물학을 활용하는 통제된 방식으로 단백질 생산, 전사 및 번역 과정(DNA→RNA→단백질)을 재구성하는 능력을 입증하였다. 여기에서 우리는 강력한 세균 용해물의 생산을 포함하여 세포 자유 발현 시스템을 준비하기 위한 프로토콜을 설명하고, 합성 세포를 형성하기 위하여 콜레스테롤이 풍부한 지질 기지를 둔 거대한 unilamellar 소포 (GUV) (즉, 안정한 리포솜) 안쪽에 이 용해물을 캡슐화합니다. 이 프로토콜은 활성 세균 용해물의 생산을 포함하는 합성 세포의 성분을 제조하는 방법을 설명하고, 이어서 수중 오일 에멀젼 전달 방법에 기초하여 합성 세포의 상세한 단계별 제조를 기술한다. 이들은 단백질의 다른 모형을 생산하기 위한 높은 다양성으로 간단하고 적당한 방법으로 합성 세포의 수백만의 생산을 촉진합니다. 얻어진 합성 세포는 고립된 환경에서 단백질/RNA 생산 및 활동을 조사하기 위하여, 지시된 진화에서, 또한 바디 안쪽에 치료 단백질의 온디맨드 생산을 위한 통제된 약 납품 플랫폼으로 이용될 수 있습니다.
서론
합성 세포는 인공 세포와 같은 입자로서, 유전자 코드1,,2,,3에기초하여 단백질을 분열, 포름, 합성하는 능력과 같은 살아있는 세포의 하나 또는 다중 기능을 모방한다. 무세포 단백질 합성 (CFPS) 시스템을 둘러싸는 합성 세포는 DNA 템플릿의 변경 에 따라 다양한 단백질과 RNA 서열을 생산하는 능력으로 인해 높은 모듈성을 가지고 있습니다. 단백질 생산의 현재 접근법에 대한 매력적인 대안을 제시하는 CFPS 시스템은 세포 용해물, 정제 성분 또는 합성 성분을 기반으로 하며 리보솜, RNA 폴리머라제, 아미노산 및 에너지 원(예를 들어, 3-인산성산염 및 아데닌5,6,7,8,트리포스페이트)과 같은 단백질 합성에 필요한 모든 전사 및 번역 기계를4,포함합니다.9 지질 소포 내....
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프로토콜
참고: 완전한 합성 세포의 생산 프로토콜의 그림은 그림 1에제시되어 있습니다. 사용자의 필요에 따라, 프로토콜의 단백질 발현(섹션 3.2) 및 합성 세포 형성(섹션 4) 부분도 독립적으로 수행될 수 있다(일부 적응).
1. S30-T7 용해의 준비
- 줄무늬 플레이트는 50 μg/mL ampicillin으로 보충된 LB-한천 플레이트상에서 pAR1219 플라스미드를 발현하는 T7 RNA 폴리머라제로 변형된 대장균 BL21(DE3) 박테리아를 단일 콜로니를 얻었다.
- 스타터 용액 준비: 단일 콜로니를 100 mL Erlenmeyer 플라스크에 50 μg/mL ampicillin으로 보충한 LB-미디어 5 mL에 접종하고 250 rpm 및 37°C에서 바닥 인큐베이터 셰이커를 사용하여 하룻밤 동안 성장합니다. 중복을 준비합니다.
- 각 5 mL 스타터를 500 mL의 TB 매체에 500 mL로 별도로 접종하여 배플이 있는 2 L Erlenmeyer 플라스크에 50 μg/mL ampicillin을 보충하고 250 rpm 및 37°C에서 바닥 인큐베이터 셰이커를 사용하여 성장하여 OD600 0.8-1에 도달할 때까지 ....
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결과
우리는 지질 소포 내부의 BL21 대장균에 기초한 S30-T7 CFPS 시스템을 캡슐화하여 합성 세포의 제조를 위한 프로토콜을 제시한다. 도 2에각 단계의 이미지를 포함하는 준비 과정에 대한 개략적 설명이 제시된다. 합성 세포 전처리 과정의 성공은 각 단계의 적절한 성능에 의존하고 상이한 파라미터에 의해 영향을 미친다. 프로토콜은 특정 단백질의 생산을 수용하도록 조정되어야 한다.
모델 단백질 슈퍼 폴더 녹색 형광 단백질(sfGFP) 및 르닐라 루시퍼라아제를 T7 프로모터로 발현한 플라스미드는 CFPS 벌크 반응 및 합성 세포에 도입되었고, 단백질 생산은 서양 블롯, 유세포 분석, 현미경 및 분광법을 포함한 다양한 방법을 사용하여 평가되었다(그림3). sfGFP-그의6 태그 단백질(~27 kDa
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토론
이 프로토콜은 다량의 단백질 생산 합성 세포를 생산하기 위한 간단하고 저렴한 방법을 소개합니다. 활성 세포의 수율은 몇 가지 중요한 단계에 중점을 둔 프로토콜의 신중하고 정확한 실행에 달려 있습니다. 이 방법의 분해 제제 섹션에서, 세균 분해에 충분한 양의 단백질을 달성하기 위해 세포 가포하기 전에 적절한 박테리아 밀도에 도달하는 것이 필수적이다. 둘째, 용해 과정은 단백질 활성을 유지하기 위해 액체 질소로 신속하게 4°C 및 용해액을 동결하여 수행해야 한다. 더욱이, 이 프로토콜에서는 T7 RNA 폴리머라제발현을 pAR1219 플라스미드로 형질전환한 대장균 BL21(DE3) 세포를 사용하였다. 박테리아의 다른 긴장이 이용되는 경우에, 용해 농도에 변경은 RNA 중합효소 및 리보솜의 만족스러운 양에 도달하기 위하여 요구될 수 있습니다. 동일한 박테리아 균주를 사용하는 경우에도 다른 용해수기 생산은 일부 배치 대 배치 가변성을 가질 수 있습니다.
소포 생산 섹션에는.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
이 작품은 ERC-STG-2015-680242에 의해 지원되었다.
저자는 또한 테크니온 통합 암 센터 (TICC)의 지원을 인정; 러셀 베리 나노 기술 연구소; 로리 I. 로키 생명 과학 및 공학 학제 센터; 카민 그랜트에 대한 이스라엘 경제부 (52752); 이스라엘 과학기술우주부 – 수석과학자실 (3-11878); 이스라엘 과학 재단 (1778/13, 1421/17); 이스라엘 암 협회 (2015-0116); GIF 젊은 교부금을위한 과학 연구 개발을위한 독일 - 이스라엘 재단 (I-2328-1139.10/2012); 경력 통합 교부금에 대한 유럽 연합 FP-7 IRG 프로그램 (908049); 인지질 연구 센터 그랜트; 암 연구를위한 로젠 블라트 재단, 말라트 가족 재단 보조금; 그리고 Unger 가족 재단. A. 슈뢰더는 알론과 타우브 펠로우십을 인정한다. O. 아디르는 셔먼과 구트위르트의 펠로우십을 인정한다. G. 첸은 셔먼 펠로우십을 인정한다. N. 크린스키는 로스차일드 제왕절개 재단의 바론스 아리안 드 로스차일드 여성 박사 과정에 대해 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| A. 1단계(S30-T7 용해물 준비)에 필요한 시약 | |||
| E.coli BL21(DE3) | NEB | C2527 | 대장균 BL21 (DE3). |
| pAR1219 | Sigma | T2076 | 변형을 위한 TargeTron 벡터. |
| 50 mg/mL 암피실린 | 시그마 | A9518 | -20°C에 보관됩니다. |
| 10 g/L 박토 트립톤 | BD Bioscience | 211705 | Luria Bertani (LB) 한천 (1.5 %) 플레이트의 준비. |
| 10 g/L 염화나트륨 (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast 추출물 | BD Bioscience | 212750 | |
| 15 g/L 한천 정제 | Merck | 1.01614.5007 | |
| 50 µ g/mL 암피실린 | 시그마 | A9518 | |
| 10 g/L 박토-트립톤 | BD Bioscience | 211705 | Luria Bertani(LB) 배지(20mL) 준비용. |
| 10 g/L 염화나트륨 (NaCl) | Bio-Lab | 19030591 | |
| 5 g/L Bacto-Yeast 추출물 | BD Bioscience | 212750 | |
| 50 &마이크로; g/mL 암피실린 | 시그마 | A9518 | |
| 12 g/L 박토-트립톤 | BD Bioscience | 211705 | TB(Terrific Broth) 매체(1L) 준비용. |
| 24 g/L 박토 효모 추출물 | BD Bioscience | 212750 | |
| 4% (v/v) 글리세롤 무수 | Bio-Lab | 7120501 | |
| 2.32 g/L K2HPO4 | 스펙트럼 화학물질 | P1383 | |
| 12.54 g/L KH2PO4 | 스펙트럼 화학물질 | P1380 | |
| 50 &마이크로; g/mL 암피실린 | 시그마 | A9518 | |
| 100mM 이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)의 원액 | INALCO | INA-1758-1400 | 0.2 µ를 사용하여 필터링되었습니다. m 친수성 PVDF 주사기 필터. |
| 0.1M 디티오트레이톨(DTT)의 원액 | TCI | D1071 | 0.2 &마이크로를 사용하여 필터링되었습니다. m 친수성 PVDF 주사기 필터. |
| pH = 7.4에서 10mM 트리스-아세테이트 | Sigma | T1503 | S30 용해물 완충액(1.5L) |
| 14mM 마그네슘 아세테이트 | Merck | 1.05819.0250 | |
| 60mM 아세트산 | 칼륨 Carlo Erba | 470147 | |
| 1mM DTT | TCI | D1071 | |
| 0.5mL/L 2-메르캅토에탄올 | Sigma | M6250 | |
| 1단계에 필요한 장비 | |||
| 100 mL 멸균 삼각 플라스크 | Thermo Scientific | 50-154-2846 | 2 플라스크 |
| 2 L 멸균 삼각 플라스크 (배플 포함 | KIMAX-KIMBLE | 25630 | 2 플라스크 |
| 바닥 인큐베이터 쉐이커 | MRC | TOU-120-2 | 실험실 쉐이커 인큐베이터 450x450mm, 400rpm, 70 ° C |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75004270 | (75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX 고정 각도 로터. 최소 13,000 x g. * 4 °C.에 미리 냉각하는. |
| 고압 균질화기 | AVESTIN | EmulsiFlex-C3 | 4°C로 사전 냉각 |
| -80oC freezer | SO-LOW | U85-18 | |
| 멸균된 1.5 mL 플라스틱 튜브 | Eppendorf | 30120086 | -20 °C로 사전 냉각하는 것이 좋습니다. |
| 분광광도계 | : TECAN | IN-MNANO | Infinite M200 pro |
| 96-well transparent plate | Thermo Scientific | 167008 | |
| Sterilized graduated cylinder | Corning | ||
| sterilized centrifuge tubes | Eppendorf | 30120086 | -20°C로 예냉각하는 것이 좋습니다. |
| 멸균된 피펫 팁 | Corning | 은 -20°C로 사전 냉각하는 것이 좋습니다. | |
| 분쇄 얼음 양동이 | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 소형 액체 질소 탱크 | NALGENE | 4150-4000 | |
| B. 3 단계 (유액 제제의 지질)에 필요한 시약 : < / strong> | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Lipoid | 556400 | 분말 |
| 콜레스테롤 | 시그마 | C8667 | 분말 |
| 클로로포름 | 바이오 랩 | 3082301 | |
| 미네랄 오일 | 시그마 | M5904 | 경유 |
| < 강> 2 단계에 필요한 장비 < / 강> | |||
| 와류 믹서 | 과학 산업 | SI-0256 | |
| 가열 블록 | TECHNE | FDB03AD | 80 °C. 로 예열되어 온도를 제어할 수 있어야 합니다. |
| 2mL 스크류 넥 유리 바이알 | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | 더 큰 스케일의 경우 50mL 팔콘을 사용하고 회전 증발기를 사용하여 클로로포름을 증발시킵니다. |
| 9mm 스크류 캡 | CSI Analytical Innovations | C395R-09LC | |
| strong>C. 3 단계 (내부 및 공급 반응 혼합물)에 필요한 시약 : < / strong> | |||
| HEPES | Spectrum | H1089 | 1 M HEPES-KOH (pH = 8) - pH 버퍼 |
| 수산화 칼륨 (KOH) | Frutarom | 55290 | |
| 1 M 마그네슘 아세테이트 | Merck | 1.05819.0250 | 코팩터 및 음전하 안정제. |
| 1 M 칼륨 아세테이트 | Carlo Erba | 470147 | 음전하 안정제. |
| 5.2 M 암모늄 아세테이트 | Merck | 1.01116.1000 | 음전하를 안정화합니다. |
| 50%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜 6000(PEG) | Merck | 8.07491.1000 | 거대분자의 농도를 증가시킵니다. |
| 0.5 M 3-포스포글리세레이트 (3-PGA) | Sigma | P8877 | 2차 에너지원. |
| 50 mM 아미노산 혼합물 I | Sigma | LAA21-1KT | 아미노산 첨가제. 함유: 다음의 17 천연 아미노산 각각 50 mM - 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 그리고 발린. |
| 50 mM 아미노산 혼합물 II | Sigma | LAA21-1KT | 아미노산 첨가제. 함유 성분: 트립토판, 페닐알라닌, 티로신의 3가지 천연 아미노산 각각이 50 mM. |
| 100mM 아데닌 삼인산(ATP) | Sigma | A3377 | 뉴클레오티드 및 에너지원. |
| 50mM 구아니딘 삼인산(GTP) | Sigma | G8877 | 뉴클레오티드 및 에너지원. |
| 100 mM 우리딘 트리포스페이트(UTP) | ACROS ORGANICS | 226310010 | 뉴클레오티드 첨가제. |
| 100 mM 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | INALCO | INA-1758-1400 | 유전자 발현 유도. |
| 2 M 설탕 | J.T. Baker | 1933078 | 밀도 구배 생성. |
| 2 M 포도 | 시그마 | 16301 | 밀도 구배를 생성합니다. |
| H2O 초순수(UPW) | Bio-Lab | 2321777500 | DNase & RNase free |
| S30-T7 용해물 | _ | _ | 1단계에서 준비합니다. 전사 출처 & translation components. -80 °에 저장; C, 사용 직전에 부서진 얼음에서 해동합니다. |
| 선택한 DNA 플라스미드 재고 | _ | _ | 요청된 단백질에 대한 염기서열을 포함합니다. Under T7 promotor |
| D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation) | |||
| Floor incubator shaker or Thermomixer | MRC | TOU-120-2 | Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 ° C |
| PHMT 그랜트 바이오 | PSC18 | 써모믹서 | |
| 원심분리기 | Thermo Scientific | 75004270 | (75003629) - TX-400 4 x 400mL 스윙 버킷 로터. 15mL 크기의 튜브에 적합합니다. 스윙 버킷 선호. 최소 1000 x g. 4°C로 사전 냉각해야 합니다. |
| 테이블 원심분리기 | Thermo Scientific | 75002420 | (75003424) - 24 x 1.5/2.0mL 로터, ClickSeal. Eppendorf 바이알에 적합. 4°C로 사전 냉각. |
| Vortex mixer | Scientific industries | SI-0256 | |
| 분쇄 얼음 양동이 | Bel-Art | M18848-4001 | |
| 2 mL 스크류 넥 유리 바이알 | CSI Analytical Innovations | VT009M-1232 | |
| 멸균 15 mL 플라스틱 튜브 | Thermo Scientific | 339651 | |
| 멸균 1.5 mL 플라스틱 튜브 | Eppendorf | 30120086 | |
| 멸균 피펫 팁 | Corning | 오토클레이브로 멸균. |
참고문헌
- Blain, J. C., Szostak, J. W. Progress toward synthetic cells. Annual review of biochemistry. 83, 615-640 (2014).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Procee....
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