Préparation des cellules synthétiques produisant des protéines à l’aide d’extraits bactériens exempts de cellules, de liposomes et de transfert d’émulsion

Summary

Ce protocole décrit la méthode, les matériaux, l’équipement et les étapes pour la préparation ascendante de l’ARN et des protéines produisant des cellules synthétiques. Le compartiment aqueux intérieur des cellules synthétiques contenait le lysate bactérien S30 encapsulé dans un bilayer lipidique (c.-à-d. liposomes stables), à l’aide d’une méthode de transfert d’émulsion d’émulsion de l’eau dans l’huile.

Abstract

L’approche d’assemblage ascendante pour la construction de cellules synthétiques est un outil efficace pour isoler et étudier les processus cellulaires dans un environnement imitant les cellules. En outre, le développement de systèmes d’expression sans cellules a démontré la capacité de reconstituer les processus de production, de transcription et de traduction de protéines (PROTÉINE DNA-ARN) d’une manière contrôlée, en exploitant la biologie synthétique. Ici, nous décrivons un protocole pour la préparation d’un système d’expression sans cellules, y compris la production d’un puissant lysate bactérien et l’encapsulation de ce lysate à l’intérieur des vésicules géantes nonilamellar à base de cholestérol (GUV) (c.-à-d. liposomes stables), pour former des cellules synthétiques. Le protocole décrit les méthodes de préparation des composants des cellules synthétiques, y compris la production de lysates bactériens actifs, suivie d’une préparation détaillée étape par étape des cellules synthétiques basée sur une méthode de transfert d’émulsion d’eau dans l’huile. Ceux-ci facilitent la production de millions de cellules synthétiques d’une manière simple et abordable avec une grande polyvalence pour produire différents types de protéines. Les cellules synthétiques obtenues peuvent être utilisées pour étudier la production et l’activité des protéines/ARN dans un environnement isolé, dans une évolution dirigée, et aussi comme une plate-forme contrôlée de livraison de médicaments pour la production à la demande de protéines thérapeutiques à l’intérieur du corps.

Introduction

Les cellules synthétiques sont des particules artificielles ressemblant à des cellules, imitant une ou plusieurs fonctions d’une cellule vivante, telles que la capacité de diviser, former des interactions membranaires et synthétiser les protéines à partir d’un code génétique^1,2,3. Les cellules synthétiques qui enferment les systèmes de synthèse des protéines sans cellules (CFPS) possèdent une modularité élevée en raison de leur capacité à produire diverses protéines et séquences d’ARN suite à des altérations dans le modèle d’ADN. Présentant une alternative attrayante aux approches actuelles de la production de protéines, les systèmes CFPS sont basés sur le lysate cellulaire, les composants purifiés ou les composants synthétiques et comprennent toutes les machines de transcription et de traduction nécessaires à la synthèse des protéines telles que les ribosomes, la polymérase à ARN, les acides aminés et les sources d’énergie (p. ex., 3-phosphoglycerate et triphosphate adénine)^4,5^,66,7,89.9 L’encapsulation d’un système CFPS à l’intérieur des vésicules lipidiques permet la production simple et efficace de protéines sans dépendre d’une cellule vivante¹⁰. En outre, cette plate-forme permet la synthèse des peptides qui peuvent se dégrader à l’intérieur des cellules naturelles, la production de protéines qui sont toxiques pour les cellules vivantes, et de modifier les protéines avec des acides aminés non naturels^11,12. Les cellules synthétiques ont été utilisées comme modèle à des fins de recherche sur les composants cellulaires minimaux nécessaires pour permettre la vie cellulaire d’un point de vue évolutif^1,13. Les cellules synthétiques ont également été utilisées pour construire et mettre en œuvre le circuit génétique et comme modèles pour l’évolution dirigée^14,15,16. D’autres études ont porté sur la capacité des cellules synthétiques à imiter l’activité biologique des cellules naturelles, visant à remplacer les cellules naturelles endommagées, telles que les cellules bêta chez les patients atteints de diabète¹⁷. En outre, la capacité de ces CFPS encapsulant des cellules synthétiques à produire une variété de protéines thérapeutiques illustre son potentiel à être incorporé dans l’utilisation clinique¹⁸.

Ici, nous décrivons un protocole ascendant à l’échelle de laboratoire(figure 1) pour la production d’ARN et de cellules synthétiques productrices de protéines à partir d’un système CFPS encapsulé dans une vésicule lipidique. Cela montre l’utilisation potentielle de plates-formes cellulaires synthétiques comme nouveaux systèmes de livraison de médicaments pour la production sur place d’un médicament protéique thérapeutique in vivo¹⁹. Des études antérieures ont étudié l’optimisation de la réaction du CFPS et des processus de préparation du lysate cellulaire^4,8,20. En outre, plusieurs techniques ont été appliquées pour la préparation des liposomes de la taille d’une cellule, telles que les méthodes de stabilisation des gouttelettes microfluidiques et polymères^21,22,23, qui diffèrent également dans la composition lipidique des liposomes^24,25,26. Dans le protocole présenté, les cellules synthétiques sont produites à l’aide d’une méthode de transfert d’émulsion d’eau dans l’huile et le processus d’encapsulation est effectué à basse température (lt;4 ‘C)^{5,10,24,27,28}. Ces conditions douces se sont avérées favorables pour conserver l’intégrité biofonctionnelle des machines moléculaires, à savoir les ribosomes et les protéines^27,29,30. La composition lipidique des particules se compose à la fois de cholestérol et de 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC). Le premier se trouve dans toutes les membranes cellulaires des mammifères et est essentiel pour la stabilité, la rigidité et la réduction de la perméabilité de la membrane, et le second imite la composition des phospholipides mammifères^11,13. La base moléculaire de transcription et de traduction cellulaire est extraite de la souche BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), qui est transformée avec la polymérase plasmide pAR1219 pour augmenter la polymérase de l’ARN T7 pour augmenter la puissance du SFC et la synthèse des protéines. Ce système a été utilisé pour produire des protéines diagnostiques et thérapeutiques, avec des poids moléculaires allant jusqu’à 66 kDa in vitro et in vivo^19,31. Le protocole suivant fournit une méthode simple et efficace pour la production du système cellulaire synthétique, qui peut répondre à un large éventail de questions fondamentales associées à la synthèse des protéines dans la nature et peut également être utilisé pour les applications d’administration de médicaments.

Protocol

REMARQUE : L’illustration du protocole complet de production des cellules synthétiques est présentée à la figure 1. Selon les besoins de l’utilisateur, l’expression protéique (article 3.2) et les parties de formation de cellules synthétiques (article 4) du protocole peuvent également être effectuées indépendamment (avec quelques adaptations). 1. Préparation de S30-T7 lysate Plaque de stase la bactérie E. coli BL21(DE3) transfor…

Representative Results

Nous présentons un protocole pour la préparation des cellules synthétiques en encapsulant un système S30-T7 CFPS basé sur BL21 E. coli à l’intérieur des vésicules lipidiques. Une description schématique du processus de préparation qui comprend une image de chaque étape est présentée à la figure 2. Le succès du processus de préparation des cellules synthétiques dépend de la performance appropriée de chaque étape et effectuée par différents paramètres. Le prot…

Discussion

Ce protocole introduit une méthode simple et abordable pour la production de grandes quantités de cellules synthétiques productrices de protéines. Le rendement des cellules actives dépend de l’exécution soigneuse et précise du protocole en mettant l’accent sur plusieurs étapes critiques. Dans la section de préparation lysate de cette méthode, il est essentiel d’atteindre la densité appropriée de bactéries avant la lyse cellulaire pour obtenir une quantité suffisante de protéines dans le lysate bacté…

Materials

A. Reagents required for step 1 (S30-T7 lysate preparation)
E.coli BL21 (DE3)	NEB	C2527	E.coli BL21 (DE3).
pAR1219	Sigma	T2076	TargeTron vector for transformation.
Stock solution of 50 mg/mL Ampicillin	Sigma	A9518	Stored at -20 °C.
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) agar (1.5%) plate.
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
15 g/L Agar agar purified	Merck	1.01614.5007
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
10 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Luria Bertani (LB) media (20 mL).
10 g/L Sodium chloride (NaCl)	Bio-Lab	19030591
5 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
12 g/L Bacto-tryptone	BD Bioscience	211705	For preparation of Terrific Broth (TB) media (1 L).
24 g/L Bacto-Yeast extract	BD Bioscience	212750
4% (v/v) Glycerol anhydrous	Bio-Lab	7120501
2.32 g/L K2HPO4	Spectrum chemical	P1383
12.54 g/L KH2PO4	Spectrum chemical	P1380
50 µg/mL Ampicillin	Sigma	A9518
Stock solution of 100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
Stock solution of 0.1 M dithiothreitol (DTT)	TCI	D1071	Filtered using 0.2 µm hydrophilic PVDF syringe filter.
10 mM Tris-acetate at pH = 7.4	Sigma	T1503	S30 lysate buffer (1.5 L)
14 mM magnesium acetate	Merck	1.05819.0250
60 mM potassium acetate	Carlo Erba	470147
1 mM DTT	TCI	D1071
0.5 mL/L 2-mercaptoethanol	Sigma	M6250
Equipment required for step 1
100 mL sterilized Erlenmeyer flasks	Thermo Scientific	50-154-2846	2 flasks
2 L sterilized Erlenmeyer flasks with baffles	KIMAX-KIMBLE	25630	2 flasks
Floor incubator shaker	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003340) – Fiberlite F10-6 x 100 LEX Fixed-Angle Rotor. Should enable at least 13,000 x g.     * Pre-cooled to 4 °C.
High pressure homogenizer	AVESTIN	EmulsiFlex-C3	Pre-cooled to 4 °C.
-80oC freezer	SO-LOW	U85-18
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Spectrophotometer	TECAN	IN-MNANO	Infinite M200 pro
96-well transparent plate	Thermo Scientific	167008
Sterilized graduated cylinder	Corning
Sterilized centrifuge tubes	Eppendorf	30120086	Preferably pre-cooled to -20 °C.
Sterilized pipette tips	Corning		Preferably pre-cooled to -20 °C.
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
Small liquid nitrogen tank	NALGENE	4150-4000
B. Reagents required for step 3 (lipids in oil solution preparation):
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)	Lipoid	556400	Powder
Cholesterol	Sigma	C8667	Powder
Chloroform	Bio-Lab	3082301
Mineral oil	Sigma	M5904	Light oil
Equipment required for step 2
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Heating block	TECHNE	FDB03AD	Pre-heated to 80 °C. Should enable controlled temperature.
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232	For a larger scale, use 50 mL falcons and evaporate the chloroform using rotary evaporator.
9mm Screw Cap	CSI Analytical Innovations	C395R-09LC
C. Reagents required for step 3 (inner and feeding reaction mixtures):
HEPES	Spectrum	H1089	1 M HEPES-KOH (pH = 8) – pH buffer
Potassium hydroxide (KOH)	Frutarom	55290
1 M Magnesium acetate	Merck	1.05819.0250	Co-factor and negative charge stabilizor.
1 M Potassium acetate	Carlo Erba	470147	Negative charge stabilizor.
5.2 M Ammonium acetate	Merck	1.01116.1000	Stabilizes negative charge.
50% (w/v) Polyethylene glycol 6000 (PEG)	Merck	8.07491.1000	Increases the concentration of the macromolecules.
0.5 M 3-phosphoglycerate (3-PGA)	Sigma	P8877	Secondary energy source.
50 mM Amino acids mixture I	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 17  natural amino acids – alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, proline, serine, threonine, and valine.
50 mM Amino acids mixture II	Sigma	LAA21-1KT	Amino acids additive. Contains: 50 mM of each of the following 3 natural amino acids – tryptophan, phenylalanine, and tyrosine.
100 mM Adenine triphosphate (ATP)	Sigma	A3377	Nucleotides & energy source.
50 mM Guanidine triphosphate (GTP)	Sigma	G8877	Nucleotides & energy source.
100 mM Uridine triphosphate (UTP)	ACROS ORGANICS	226310010	Nucleotides additive.
100 mM Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	INALCO	INA-1758-1400	Genes expression induction.
2 M Sucrose	J.T. Baker	1933078	Generating a density gradient.
2 M Glucose	Sigma	16301	Generating a density gradient.
H2O UltraPure Water (UPW)	Bio-Lab	2321777500	DNase & RNase free
S30-T7 lysate	_	_	Prepared at step 1.                                                                        Source of transcription & translation components. Store at -80 °c, thaw on crashed ice just before usage.
Stock of DNA plasmid of choice	_	_	Contains the sequence for the requested protein. Under T7 promotor
D. Equipment required for step 4 (synthetic cells preparation)
Floor incubator shaker or Thermomixer	MRC	TOU-120-2	Laboratory shaker incubator 450x450mm, 400rpm, 70 °C
	PHMT Grant Bio	PSC18	Thermomixer
Centrifuge	Thermo Scientific	75004270	(75003629) – TX-400 4 x 400mL Swinging Bucket Rotor. Suited for 15 mL sized tubes. Preferably swinging buckets. Should enable at least 1000 x g. Pre-cooled to 4 °C.
Table centrifuge	Thermo Scientific	75002420	(75003424) – 24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal. Suited for Eppendorf vials. Pre-cooled to 4 °C.
Vortex mixer	Scientific industries	SI-0256
Crushed ice bucket	Bel-Art	M18848-4001
2 mL screw neck glass vials	CSI Analytical Innovations	VT009M-1232
Sterile 15 mL plastic tubes	Thermo Scientific	339651
Sterilized 1.5 mL plastic tubes	Eppendorf	30120086
Sterilized pipette tips	Corning		Sterilized by autoclave.