심근 경색 마우스 모델에서 수정된 mRNA의 납품
Summary
이 프로토콜은 마우스에서 심근 경색 후 modRNA를 사용하여 관심 유전자를 일시적으로 조절하는 간단하고 일관된 방법을 제시합니다.
Abstract
심근 경색 (MI)은 서방 세계에서 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 지난 10 년 동안, 유전자 치료는 심장 질환에 대 한 유망한 치료 옵션이 되었다, 그것의 효율성 및 뛰어난 치료 효과 때문에. 손상된 조직 포스트 MI를 복구하기 위한 노력의 일환으로, 각종 연구 결과는 DNA 기지를 둔 바이러스성 유전자 치료를 채택했습니다 그러나 전달된 유전자, 부종, 부정맥 및 심장 비대의 가난하고 통제되지 않는 발현 때문에 상당한 장애물에 직면했습니다. 합성 변형 된 mRNA (modRNA)는 게놈 통합의 위험없이 심장 조직에 높은, 일시적인, 안전, 비 면역 원성 및 제어 된 mRNA 전달을 제공하는 새로운 유전자 치료 접근법을 제시한다. 이러한 놀라운 특성으로 인해 심장에 종 모양의 약물 역학과 결합 된 modRNA는 심장 질환 치료를위한 매력적인 접근 방식이되었습니다. 그러나 생체 내에서 그 효과를 높이기 위해서는 일관되고 신뢰할 수 있는 전달 방법을 따라야 합니다. 따라서, 생체 내 용도에 대한 modRNA 사용의 modRNA 전달 효율 및 수율 일관성을 극대화하기 위해 마우스 MI 모델에서 modRNA 내심 내 주입을 제조하고 전달하는 최적화된 방법이 제시된다. 이 프로토콜은 modRNA 전달을 기본 및 번역 연구에 더 쉽게 접근할 수 있게 합니다.
Introduction
유전자 치료는 인간 질환의 치료, 치료 또는 예방을 위한 핵산의 전달을 포함하는 강력한 도구입니다. 심장질환에 대한 진단 및 치료 접근법의 진행에도 불구하고 심근경색(MI) 및 심부전(HF)에서 유전자전달에 있어 성공이 제한적이다. 유전자 치료의 과정이 간단해 보이는 것처럼, 특정 전달 차량을 사용하기 전에 최적화해야 하는 많은 요인을 고려하면 현저하게 복잡한 접근법입니다. 올바른 전달 벡터는 인체 내부에서 비 면역원성, 효율적이고 안정적이어야 합니다. 이 분야의 노력은 바이러스 성 또는 비 바이러스성 이라는 두 가지 유형의 배달 시스템을 생성했습니다. 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노 관련 바이러스에 의한 유전자 전달을 포함한 널리 사용되는 바이러스 시스템은 뛰어난 전달 능력을 보여주었습니다. 그러나, 클리닉에서의 그들의 사용은 강한 면역 반응 유도1,종양 발생2의위험, 또는 중화 항체3의존재로 인해 제한되며, 모두 인간 유전자 치료에서 바이러스 벡터의 광범위하고 효과적인 적용에 큰 장애물로 남아 있다. 한편, 이들의 인상적인 발현 패턴에도 불구하고, 벌거벗은 플라스미드 DNA의 전달은 낮은 형질 전달 효율을 표시하고, mRNA 전달은 RNase4에의한 저하에 높은 면역원성과 감수성을 제시한다.
mRNA 의 분야에서 광범위한 연구와 함께, modRNA는 전통적인 벡터5에비해 수많은 장점으로 인해 심장및 다양한 다른 장기에 유전자를 전달하는 매력적인 도구가되었다. 자연적으로 발생하는 의사 분비딘을 가진 uridine의 완전한 교체는 선천적인 면역 반응의 최소한의 유도와 게놈 통합6의리스크로, 더 강력하고 일시적인 단백질 발현을 초래합니다. 최근에 확립된 프로토콜은 합성 mRNA7의안정성과 전이를 증가시킴으로써 단백질 번역을 더욱 향상시키는 최적화된 양의 반대로 캡 아날로그(ARCA)를 사용한다.
이전 보고서는 MI 후 설치류 심근에서 modRNA에 의해 전달된 다양한 기자 또는 기능성 유전자의 발현을 보여주었다. modRNA 적용을 통해 심근세포와 비심근세포 모두를 포함한 심근증의 중요한 영역은 혈관신생9,10,심장세포 생존 11, 및,심근세포 증식(12)을12유도하기 위해 심장 후11손상(8)을 성공적으로 전염시켰다. 돌연변이된 인간 폴리스테틴에 대한 인코딩된 modRNA의 단일 투여는 마우스 성인 CM의 증식을 유도하고 심장 기능을 크게 증가시키고 흉터 크기를 감소시키고 모세혈관 밀도를 증가시키고 MI12이후 4주 후에 도포밀도를 증가시킨다. 최근 연구는 돼지 모델(10)에서VEGFA modRNA의 응용 프로그램과 MI 후 향상 된 심장 기능을보고했다.
따라서, 심장 분야에서 modRNA의 인기가 증가함에 따라, MI 이후 심장에 modRNA를 전달하기 위한 프로토콜을 개발하고 최적화하는 것이 필수적이다. 이 프로토콜 및 비디오에 도시된 방법은 왼쪽 전방 내림차순 동맥(LAD)의 영구 결찰에 의해 마우스 MI의 표준 외과 적 절차를 시연하고, modRNA의 3개의 현장 내심 주사가 뒤따릅니다. 이 논문의 목적은 모RNA 적용이 심장 유전자 치료에 널리 접근할 수 있도록 뮤린 심오카르슘에 modRNA 전달의 매우 정확하고 재현 가능한 방법을 명확하게 정의하는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유전자 치료는 심장 질환의 치료를 크게 발전시킬 수 있는 엄청난 잠재력을 보여주었습니다. 그러나, HF의 치료를 위한 초기 임상 시험에 채택 된 전통적인 도구는 제한된 성공을 보이고 심각한 부작용과 관련되어 있다. 변형된 RNA는 심장에서 유전자 전달 도구로 지속적으로 인기를 얻고 있는 비바이러스 유전자 전달을 제시한다. ModRNA는 번역을 위한 유전자의 핵 현지화를 요구하지 않으며, 따라?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 앤 아누 쿠리안이 이 원고에 도움을 주었습니다. 이 작품은 잔기 연구소에 수여 심장 창업 보조금에 의해 지원되었다 또한 NIH 보조금 R01 HL142768-01에 의해
Materials
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
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