Consegna di mRNA modificato in un modello di topo di infarto miocardico
Summary
Questo protocollo presenta un modo semplice e coerente per eseguire l’upregolazione transitoria di un gene di interesse usando modRNA dopo l’infarto miocardico nei topi.
Abstract
L’infarto miocardico (MI) è una delle principali cause di morbilità e mortalità nel mondo occidentale. Nell’ultimo decennio, la terapia genica è diventata un’opzione di trattamento promettente per le malattie cardiache, grazie alla sua efficienza e agli eccezionali effetti terapeutici. Nel tentativo di riparare il tessuto danneggiato post-MI, vari studi hanno impiegato la terapia genica virale o basata sul DNA, ma hanno affrontato notevoli ostacoli a causa della scarsa e incontrollata espressione dei geni consegnati, dell’edema, dell’aritmia e dell’ipertrofia cardiaca. L’mRNA modificato sintetico (modRNA) presenta un nuovo approccio alla terapia genica che offre un’elevata, transitoria, sicura, non immunogenica e controllata e controllata esodaal tessuto cardiaco senza alcun rischio di integrazione genomica. Grazie a queste notevoli caratteristiche combinate con la sua farmacocinetica a forma di campana nel cuore, il modRNA è diventato un approccio attraente per il trattamento delle malattie cardiache. Tuttavia, per aumentare la sua efficacia in vivo, è necessario seguire un metodo di consegna coerente e affidabile. Quindi, per massimizzare l’efficienza di consegna del modRNA e la coerenza di rendimento nell’uso di modRNA per applicazioni in vivo, viene presentato un metodo ottimizzato di preparazione e somministrazione dell’iniezione intracardiaca del modRNA in un modello MI del mouse. Questo protocollo renderà la consegna di modRNA più accessibile per la ricerca di base e traslazionale.
Introduction
La terapia genica è un potente strumento che coinvolge la consegna di acidi nucleici per il trattamento, la cura o la prevenzione delle malattie umane. Nonostante i progressi compiuti negli approcci diagnostici e terapeutici per le malattie cardiache, c’è stato un successo limitato nella fornitura di geni nell’infarto miocardico (MI) e nell’insufficienza cardiaca (HF). Per quanto semplice sembri il processo di terapia genica, si tratta di un approccio marcatamente complesso considerando i molti fattori che devono essere ottimizzati prima di impiegare un particolare veicolo di consegna. Il vettore di consegna corretto deve essere non immunogenico, efficiente e stabile all’interno del corpo umano. Gli sforzi in questo campo hanno generato due tipi di sistemi di consegna: virali o non virali. I sistemi virali ampiamente utilizzati, tra cui il trasferimento genico mediante adenovirus, retrovirus, lentivirus o virus adeno-associato, hanno dimostrato un’eccezionale capacità di trasduzione. Tuttavia, il loro uso nelle cliniche è limitato a causa della forte risposta immunitaria indotta1, rischio di tumorigenesi2, o la presenza di anticorpi neutralizzanti3, che rimangono tutti un grande ostacolo all’applicazione ampia ed efficace di vettori virali nella terapia genica umana. D’altra parte, nonostante il loro impressionante modello di espressione, la consegna di DNA plasmide nudo mostra una bassa efficienza di trasfezione, mentre il trasferimento di mRNA presenta un’elevata immunogenicità e suscettibilità alla degradazione da parte di RNase4.
Con la vasta ricerca nel campo dell’mRNA, modRNA è diventato uno strumento attraente per la consegna di geni al cuore e vari altri organi a causa dei suoi numerosi vantaggi rispetto ai vettori tradizionali5. La sostituzione completa dell’uridina con pseudouridina naturale si traduce in un’espressione proteica più robusta e transitoria, con minima induzione di risposta immunitaria innata e rischio di integrazione genomica6. I protocolli stabiliti di recente utilizzano una quantità ottimizzata di analogico anti-tap-tap inganompio (ARCA) che migliora ulteriormente la traduzione delle proteine aumentando la stabilità e la transabilità del mRNA sintetico7.
Rapporti precedenti hanno dimostrato l’espressione di vari reporter o geni funzionali forniti da modRNA nel miocardio del roditore dopo l’MI. Con le applicazioni modRNA, aree significative del miocardio, tra cui cardiomiociti e non cardiomiociti, sono stati trasettati con successo lesioni post-cardiache8 per indurre l’angiogenesi9,10, la sopravvivenza delle cellule cardiache11, e la proliferazione cardiomiocite12. Una singola somministrazione di modRNA codificato per follistatina umana mutata 1 induce la proliferazione di TRI adulti topo e aumenta significativamente la funzione cardiaca, diminuisce la dimensione della cicatrice e aumenta la densità capillare 4 settimane dopo-MI12. Uno studio più recente ha riferito una migliore funzione cardiaca dopo l’MI con l’applicazione del modRNA VEGFA in un modello suina10.
Così, con la maggiore popolarità del modRNA in campo cardiaco, è essenziale sviluppare e ottimizzare un protocollo per la consegna di modRNA al cuore post-MI. Herein è un protocollo che descrive la preparazione e la consegna di modRNA purificato e ottimizzato in una formulazione citrate-salina biocompatibile che fornisce una robusta e stabile espressione proteica senza stimolare alcuna risposta immunitaria. Il metodo mostrato in questo protocollo e video dimostra la procedura chirurgica standard di un MI del mouse mediante legatura permanente dell’arteria discendente anteriore sinistra (LAD), seguita da tre iniezioni intracardiache del sito di modRNA. L’obiettivo di questo documento è definire chiaramente un metodo altamente accurato e riproducibile di consegna del modRNA al miocardio murino per rendere l’applicazione del modRNA ampiamente accessibile per la terapia genica cardiaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
La terapia genica ha mostrato un enorme potenziale per far progredire significativamente il trattamento delle malattie cardiache. Tuttavia, gli strumenti tradizionali impiegati negli studi clinici iniziali per il trattamento di HF hanno dimostrato un successo limitato e sono associati a gravi effetti collaterali. L’RNA modificato presenta una distribuzione di geni non virali che sta guadagnando continuamente popolarità come strumento di trasferimento genico nel cuore. ModRNA non richiede alcuna localizzazione nucleare d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono Ann Anu Kurian per il suo aiuto con questo manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di studio di cardiologia assegnata al laboratorio di zangi e anche dalla sovvenzione NIH R01 HL142768-01
Materials
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).
