تسليم مرنا معدلة في نموذج الماوس احتشاء مايدق
Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة ومتماسكة لتشفير جين من الاهتمام بشكل عابر باستخدام modRNA بعد احتشاء عضلة القلب في الفئران.
Abstract
احتشاء عضلة القلب (MI) هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات في العالم الغربي. في العقد الماضي، أصبح العلاج الجيني خيار علاج واعد لأمراض القلب، نظرا لكفاءته وآثاره العلاجية الاستثنائية. في محاولة لإصلاح الأنسجة التالفة بعد MI، استخدمت دراسات مختلفة العلاج الجيني القائم على الحمض النووي أو الفيروسية ولكن واجهت عقبات كبيرة بسبب التعبير الفقير وغير المنضبط للجينات المسلمة، وذمة، وعدم انتظام ضربات القلب، وضمور القلب. الاصطناعية تعديل مرنا (MODRNA) يقدم نهج العلاج الجيني رواية التي تقدم عالية, عابرة, آمنة, غير مناعة, والسيطرة على تسليم مرنا إلى أنسجة القلب دون أي خطر من التكامل الجينومي. بسبب هذه الخصائص الرائعة جنبا إلى جنب مع الدوائية على شكل جرس في القلب، أصبحت وزارة الدفاع الأميركية نهج جذاب لعلاج أمراض القلب. ومع ذلك، لزيادة فعاليتها في الجسم الحي، يجب اتباع طريقة تسليم متسقة وموثوقة. وبالتالي، لتحقيق أقصى قدر من كفاءة التسليم MODRNA والاتساق العائد في استخدام MODRNA في التطبيقات في مجال المعلومات الحية، يتم تقديم طريقة الأمثل لإعداد وتسليم حقن داخل القلب modRNA في نموذج MI ماوس. وهذا البروتوكول سيجعل من تسليم وزارة الدفاع الأمريكية أكثر سهولة للأبحاث الأساسية والترجمة.
Introduction
العلاج الجيني هو أداة قوية تنطوي على تقديم الأحماض النووية لعلاج, علاج, أو الوقاية من الأمراض البشرية. على الرغم من التقدم المحرز في الأساليب التشخيصية والعلاجية لأمراض القلب، كان هناك نجاح محدود في توصيل الجينات في احتشاء عضلة القلب (MI) وفشل القلب (HF). كما واضحة كما يبدو عملية العلاج الجيني، بل هو نهج معقد بشكل ملحوظ بالنظر إلى العديد من العوامل التي تحتاج إلى تحسين قبل استخدام وسيلة تسليم معينة. يجب أن يكون ناقل التسليم الصحيح غير مناعيًا وفعالًا ومستقرًا داخل جسم الإنسان. وقد أدت الجهود المبذولة في هذا المجال إلى توليد نوعين من نظم الإيصال: الفيروسية أو غير الفيروسية. وقد أظهرت النظم الفيروسية المستخدمة على نطاق واسع، بما في ذلك نقل الجينات عن طريق الفيروس الغدي، أو الفيروس الرجعي، أو فيروس العدس، أو الفيروس المرتبط بالغدد الهضمية، قدرة تحويلية استثنائية. ومع ذلك، يقتصر استخدامها في العيادات بسبب استجابة المناعة القوية الناجمة1، خطر ورميجانيس2، أو وجود الأجسام المضادة تحييد3، وكلها لا تزال عقبة رئيسية أمام تطبيق واسع وفعال من ناقلات الفيروسية في العلاج الجيني البشري. من ناحية أخرى ، على الرغم من نمط التعبير المثير للإعجاب ، فإن تسليم الحمض النووي البلازمي العاري يعرض كفاءة منخفضة في نقل الحيوانات ، في حين أن نقل مرنا يقدم درجة عالية من المناعة وقابلية التدهور بواسطة RNase4.
مع البحث المكثف في مجال مررنا، أصبحت وزارة الدفاع الأمريكية أداة جذابة لتوصيل الجينات إلى القلب والأعضاء الأخرى المختلفة نظراً لمزاياها العديدة على ناقلات5التقليدية . الاستبدال الكامل للريدين مع نتائج الزائفة التي تحدث بشكل طبيعي في تعبير بروتين أكثر قوة وعابرة ، مع الحد الأدنى من الحث على الاستجابة المناعية الفطرية وخطر الاندماج الجينومي6. بروتوكولات المنشأة مؤخرا استخدام كمية الأمثل من مكافحة عكس الغطاء التناظرية (ARCA) أن يعزز أكثر من ترجمة البروتين عن طريق زيادة استقرار وtransability من الحمض النووي الاصطناعية7.
وقد أظهرت التقارير السابقة التعبير عن مختلف المراسلين أو الجينات الوظيفية التي ألقاها MODRNA في عضلة القلب القوارض بعد MI. مع تطبيقات MODRNA, مناطق كبيرة من عضلة القلب, بما في ذلك كل من cardiomyocytes و noncardiomyocytes, وقد تم بنجاح نقل العدوى بعد إصابة القلب8 للحث على تولد الأوعية9,10, بقاء الخلايا القلبية11, وdydmyocyte تكاثر12. A إدارة واحدة من MODRNA ترميز لحور البصيلاتاتين البشرية مثل 1 يدفع انتشار الماوس الكبار CMs ويزيد بشكل كبير وظيفة القلب، ويقلل من حجم ندبة، ويزيد من كثافة الشعيرات الدموية 4 أسابيع بعد MI12. وأفادت دراسة أكثر حداثة تحسين وظيفة القلب بعد MI مع تطبيق VEGFA MODRNA في نموذج الخنازير10.
وهكذا، مع زيادة شعبية وزارة الدفاع في مجال القلب، فمن الضروري لتطوير وتحسين بروتوكول لتسليم MODRNA إلى القلب بعد MI. هنا هو بروتوكول يصف إعداد وتسليم modRNA المنقى والمحسن في صياغة السيترات المالحة القابلة للتكفو الحيوي التي توفر قوية، تعبير البروتين مستقرة دون تحفيز أي استجابة مناعية. الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول والفيديو يوضح الإجراء الجراحي القياسي للفأر MI عن طريق الربط الدائم للشريان الخلفي السفلي الأيسر (LAD) ، يليه ثلاثة حقن داخل القلب من مودرنا. والهدف من هذه الورقة هو تحديد واضح طريقة دقيقة للغاية وقابلة للاستنساخ من تسليم مودرنا إلى عضلة القلب مورين لجعل تطبيق MODRNA يمكن الوصول إليها على نطاق واسع للعلاج الجيني القلبي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أظهرت العلاج الجيني إمكانات هائلة لدفع كبير في علاج أمراض القلب. ومع ذلك, الأدوات التقليدية المستخدمة في التجارب السريرية الأولية لعلاج HF أظهرت نجاحا محدودا وترتبط بآثار جانبية شديدة. الحمض النووي الريبي المعدل يقدم تسليم الجينات غير الفيروسية التي تكتسب شعبية باستمرار كأداة نقل الج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفان بـ آن أنو كوريان لمساعدتها في هذه المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من خلال منحة بدء أمراض القلب التي قدمت لمختبر زنجي وكذلك من قبل المعاهد القومية للصحة منحة R01 HL142768-01
Materials
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).
