Livraison de l’ARNm modifié dans un modèle de souris infarctus du myocarde
Summary
Ce protocole présente une façon simple et cohérente de mettre en place transitoirement un gène d’intérêt à l’aide de modRNA après l’infarctus du myocarde chez la souris.
Abstract
L’infarctus du myocarde (MI) est l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde occidental. Au cours de la dernière décennie, la thérapie génique est devenue une option de traitement prometteuse pour les maladies cardiaques, en raison de son efficacité et des effets thérapeutiques exceptionnels. Dans un effort pour réparer les tissus endommagés post-MI, diverses études ont employé la thérapie génique basée sur l’ADN ou virale, mais ont fait face à des obstacles considérables en raison de l’expression pauvre et incontrôlée des gènes livrés, œdème, arythmie, et l’hypertrophie cardiaque. L’ARNm synthétique modifié (modRNA) présente une nouvelle approche de thérapie génique qui offre une livraison élevée, transitoire, sûre, non immunisée et contrôlée d’ARNm au tissu cardiaque sans aucun risque d’intégration génomique. En raison de ces caractéristiques remarquables combinées avec sa pharmacocinétique en forme de cloche dans le cœur, modRNA est devenu une approche attrayante pour le traitement des maladies cardiaques. Toutefois, pour accroître son efficacité in vivo, une méthode de livraison cohérente et fiable doit être suivie. Par conséquent, pour maximiser l’efficacité de livraison modRNA et la cohérence de rendement dans l’utilisation modRNA pour les applications in vivo, une méthode optimisée de préparation et de livraison de l’injection intracardiaque modRNA dans un modèle mi souris est présenté. Ce protocole rendra la livraison de modRNA plus accessible pour la recherche fondamentale et translationnelle.
Introduction
La thérapie génique est un outil puissant impliquant la livraison d’acides nucléiques pour le traitement, la guérison ou la prévention des maladies humaines. Malgré les progrès dans les approches diagnostiques et thérapeutiques pour les maladies cardiaques, il y a eu un succès limité dans la livraison des gènes dans l’infarctus du myocarde (MI) et l’insuffisance cardiaque (HF). Aussi simple que le processus de thérapie génique semble, il s’agit d’une approche nettement complexe compte tenu des nombreux facteurs qui doivent être optimisés avant d’utiliser un véhicule de livraison particulier. Le vecteur de livraison correct doit être non immunogène, efficace et stable à l’intérieur du corps humain. Les efforts déployés dans ce domaine ont généré deux types de systèmes de prestation : le virus ou le non-viral. Les systèmes viraux largement utilisés, y compris le transfert de gènes par adénovirus, rétrovirus, lentivirus ou le virus adéno-associé, ont montré une capacité de transduction exceptionnelle. Cependant, leur utilisation dans les cliniques est limitée en raison de la réponse immunitaire forte induite1, le risque de tumorigenesis2, ou la présence d’anticorps neutralisants3, qui restent tous un obstacle majeur à l’application large et efficace des vecteurs viraux dans la thérapie génique humaine. D’autre part, en dépit de leur modèle d’expression impressionnant, la livraison de l’ADN plasmide nu affiche une faible efficacité de transfection, tandis que le transfert d’ARNm présente une immungénicité élevée et la susceptibilité à la dégradation par RNase4.
Avec la recherche approfondie dans le domaine de l’ARNm, modRNA est devenu un outil attrayant pour la livraison de gènes au cœur et divers autres organes en raison de ses nombreux avantages par rapport aux vecteurs traditionnels5. Le remplacement complet de l’uridine par la pseudouridine naturelle entraîne une expression protéique plus robuste et transitoire, avec une induction minimale de la réponse immunitaire innée et un risque d’intégration génomique6. Les protocoles récemment établis utilisent une quantité optimisée d’analogique anti-plafond inversé (ARCA) qui améliore encore la traduction des protéines en augmentant la stabilité et la transabilité del’ARNm synthétique 7.
Des rapports précédents ont montré l’expression de divers gènes reporter ou fonctionnels livrés par modRNA dans le myocarde de rongeur après MI. Avec les applications modRNA, des secteurs significatifs du myocarde, y compris les cardiomyocytes et les noncardiomyocytes, ont été transfectés avec succès des dommages post-cardiaques8 pour induire l’angiogenèse9,10, survie de cellules cardiaques11, et la prolifération cardiomyocyte12. Une seule administration de modRNA codée pour la follistatine humaine mutée-like 1 induit la prolifération des CM adultes de souris et augmente de manière significative la fonction cardiaque, diminue la taille de cicatrice, et augmente la densité capillaire 4 semaines après-MI12. Une étude plus récente a rapporté la fonction cardiaque améliorée après MI avec l’application de VEGFA modRNA dans un modèle de porc10.
Ainsi, avec la popularité accrue de modRNA dans le domaine cardiaque, il est essentiel de développer et d’optimiser un protocole pour la livraison de modRNA au cœur post-MI. Voici un protocole décrivant la préparation et la livraison de modRNA purifié et optimisé dans une formulation citrate-solution biocompatible qui fournit robuste, expression stable de protéine sans stimuler aucune réponse immunitaire. La méthode montrée dans ce protocole et vidéo démontre la procédure chirurgicale standard d’une souris MI par ligature permanente de l’artère descendante antérieure gauche (LAD), suivie de trois injections intracardiaques de site de modRNA. L’objectif de cet article est de définir clairement une méthode très précise et reproductible de livraison modRNA au myocarde murine pour rendre l’application modRNA largement accessible pour la thérapie génique cardiaque.
Protocol
Representative Results
Discussion
La thérapie génique a montré un potentiel énorme pour faire progresser de manière significative le traitement des maladies cardiaques. Cependant, les outils traditionnels utilisés dans les essais cliniques initiaux pour le traitement de la HF ont montré un succès limité et sont associés à des effets secondaires graves. L’ARN modifié présente une livraison de gène nonviral qui gagne continuellement en popularité en tant qu’outil de transfert de gènes dans le cœur. ModRNA ne nécessite aucune localisat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent Ann Anu Kurian pour son aide avec ce manuscrit. Ces travaux ont été financés par une subvention de démarrage en cardiologie accordée au laboratoire Zangi ainsi que par la subvention des NIH R01 HL142768-01
Materials
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
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