एक मायोकार्डियल इनफार्क्शन माउस मॉडल में संशोधित एमआरएनए की डिलीवरी
Summary
यह प्रोटोकॉल चूहों में मायोकार्डियल इंफेक्शन के बाद मोडरना का उपयोग करके रुचि के जीन को क्षणिक रूप से अपरेगुलेट करने का एक सरल और सुसंगत तरीका प्रस्तुत करता है।
Abstract
मायोकार्डियल इंफार्क्शन (एमआई) पश्चिमी दुनिया में रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है। पिछले एक दशक में, जीन थेरेपी हृदय रोग के लिए एक आशाजनक उपचार विकल्प बन गया है, अपनी दक्षता और असाधारण चिकित्सीय प्रभाव के कारण । क्षतिग्रस्त ऊतक पोस्ट-एमआई की मरम्मत के प्रयास में, विभिन्न अध्ययनों ने डीएनए आधारित या वायरल जीन थेरेपी को नियोजित किया है, लेकिन वितरित जीन, एडेमा, अतालता और हृदय अतिशस्त्री की खराब और अनियंत्रित अभिव्यक्ति के कारण काफी बाधाओं का सामना करना पड़ा है । सिंथेटिक संशोधित एमआरएनए (मोडरना) एक उपन्यास जीन थेरेपी दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है जो जीनोमिक एकीकरण के किसी भी जोखिम के बिना दिल के ऊतकों को उच्च, क्षणिक, सुरक्षित, गैर-िममुमोजेनिक और नियंत्रित एमआरएनए डिलीवरी प्रदान करता है। दिल में अपनी घंटी के आकार के फार्माकोकिनेटिक्स के साथ संयुक्त इन उल्लेखनीय विशेषताओं के कारण, मोडरना हृदय रोग के उपचार के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण बन गया है। हालांकि, वीवो में इसकी प्रभावशीलता बढ़ाने के लिए, एक सुसंगत और विश्वसनीय वितरण विधि का पालन करने की आवश्यकता है। इसलिए, वीवो अनुप्रयोगों में मोडरना वितरण दक्षता और प्रोडर्ना उपयोग में उपज स्थिरता को अधिकतम करने के लिए, माउस एमआई मॉडल में मोडरना इंट्राकार्डिएक इंजेक्शन की तैयारी और वितरण की एक अनुकूलित विधि प्रस्तुत की जाती है। यह प्रोटोकॉल बुनियादी और अनुवादात्मक अनुसंधान के लिए मोडरना डिलीवरी को अधिक सुलभ बनाएगा।
Introduction
जीन थेरेपी एक शक्तिशाली उपकरण है जिसमें मानव रोगों के उपचार, इलाज या रोकथाम के लिए न्यूक्लिक एसिड की डिलीवरी शामिल है। हृदय रोग के लिए नैदानिक और चिकित्सीय दृष्टिकोणों में प्रगति के बावजूद, मायोकार्डियल इंफार्क्शन (एमआई) और हार्ट फेलियर (एचएफ) में जीन के वितरण में सीमित सफलता मिली है। जीन थेरेपी की प्रक्रिया के रूप में के रूप में सीधा लगता है, यह एक स्पष्ट रूप से जटिल कई कारकों है कि एक विशेष प्रसव वाहन को रोजगार से पहले अनुकूलित करने की जरूरत पर विचार दृष्टिकोण है । मानव शरीर के अंदर सही डिलीवरी वेक्टर गैर-इम्यूनोजेनिक, कुशल और स्थिर होना चाहिए। इस क्षेत्र में प्रयासों ने दो प्रकार के वितरण प्रणालियों को उत्पन्न किया है: वायरल या गैर-वायरल। एडेनोवायरस, रेट्रोवायरस, लेंटीवायरस, या एडेनो से जुड़े वायरस द्वारा जीन हस्तांतरण सहित व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली वायरल प्रणालियों ने असाधारण ट्रांसडक्शन क्षमता दिखाई है । हालांकि, क्लीनिक में उनका उपयोग मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रेरित1,ट्यूमरजीनेसिस2का जोखिम, या एंटीबॉडी3को बेअसर करने की उपस्थिति के कारण सीमित है, जिनमें से सभी मानव जीन थेरेपी में वायरल वैक्टर के व्यापक और प्रभावी अनुप्रयोग के लिए एक बड़ी बाधा बने हुए हैं। दूसरी ओर, उनके प्रभावशाली अभिव्यक्ति पैटर्न के बावजूद, नग्न प्लाज्मिड डीएनए का वितरण कम ट्रांसफैक्शन दक्षता प्रदर्शित करता है, जबकि एमआरएनए हस्तांतरण आरएनएसई4द्वारा उच्च इम्यूनोजेनिसिटी और क्षरण के प्रति संवेदनशीलता प्रस्तुत करता है।
एमआरएनए के क्षेत्र में व्यापक शोध के साथ, मोडरना पारंपरिक वैक्टर 5 परइसकेकई फायदों के कारण हृदय और विभिन्न अन्य अंगों में जीन के वितरण के लिए एक आकर्षक उपकरण बन गया है। स्वाभाविक रूप से होने वाली छद्म मूत्र डाइन के साथ यूरिडीन के पूर्ण प्रतिस्थापन के परिणामस्वरूप सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और जीनोमिक एकीकरण6का जोखिम कम से कम होता है। हाल ही में स्थापित प्रोटोकॉल एंटी-रिवर्स कैप एनालॉग (एआरएए) की एक अनुकूलित मात्रा का उपयोग करते हैं जो सिंथेटिक एमआरएनए 7 कीस्थिरताऔर पारणीयता को बढ़ाकर प्रोटीन अनुवाद को और बढ़ाता है।
पिछली रिपोर्टों में एमआई के बाद कृंतक मायोकार्डियम में मोडरना द्वारा दिए गए विभिन्न रिपोर्टर या कार्यात्मक जीन की अभिव्यक्ति दिखाई गई है । मोडरना अनुप्रयोगों के साथ, कार्डियोमायोसाइट्स और नॉनकार्डियोमायोसाइट्स दोनों सहित मायोकार्डियम के महत्वपूर्ण क्षेत्रों को सफलतापूर्वक हृदय की चोट के बाद8 संक्रमित किया गया है ताकि एंजियोजेनेसिस9,10,कार्डियक सेल सर्वाइवल11और कार्डियोमायोसाइट प्रसार12को प्रेरित किया जा सके।, उत्परिवर्तित मानव फोलिस्टाटिन की तरह 1 के लिए इनकोडेड मोडरना का एक प्रशासन माउस वयस्क सीएम के प्रसार को प्रेरित करता है और कार्डियक फंक्शन को काफी बढ़ाता है, निशान का आकार कम करता है, और एमआई12के बाद 4 सप्ताह के कैपरी घनत्व को बढ़ाता है। हाल ही में एक और अध्ययन में एक सूअर मॉडल10में VEGFA modRNA के आवेदन के साथ एमआई के बाद हृदय समारोह में सुधार की सूचना दी ।
इस प्रकार, हृदय क्षेत्र में मोडरना की बढ़ती लोकप्रियता के साथ, एमआई के बाद दिल में मोडरना के वितरण के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित करना आवश्यक है। इसके बाद एक प्रोटोकॉल है जो एक जैव संगत साइट्रेट-खारा निर्माण में शुद्ध और अनुकूलित मोडर्ना की तैयारी और वितरण का वर्णन करता है जो किसी भी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को उत्तेजित किए बिना मजबूत, स्थिर प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल और वीडियो में दिखाई गई विधि बाएं पूर्वकाल उतरते धमनी (बालक) के स्थायी बंधन द्वारा माउस एमआई की मानक शल्य प्रक्रिया को दर्शाती है, जिसके बाद मोडरना के तीन साइट इंट्राकार्डिएक इंजेक्शन होते हैं। इस पेपर का उद्देश्य कार्डियक जीन थेरेपी के लिए मोडरना एप्लिकेशन को व्यापक रूप से सुलभ बनाने के लिए मुरीन मायोकार्डियम को मोडरना डिलीवरी की एक अत्यधिक सटीक और प्रजनन योग्य विधि को स्पष्ट रूप से परिभाषित करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जीन थेरेपी ने हृदय रोग के उपचार को काफी आगे बढ़ाने की जबरदस्त क्षमता दिखाई है । हालांकि, एचएफ के उपचार के लिए प्रारंभिक नैदानिक परीक्षणों में नियोजित पारंपरिक उपकरणों ने सीमित सफलता दिखाई है और गंभीर ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस पांडुलिपि के साथ उसकी मदद के लिए ऐन अनु कुरियन को स्वीकार करते हैं । इस काम को एक कार्डियोलॉजी स्टार्ट-अप अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था जो ज़ंगी प्रयोगशाला को प्रदान किया गया था और एनआईएच ग्रांट आर01 एचएल142768-01 द्वारा भी
Materials
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
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