Leverans av modifierad mRNA i en hjärtinfarkt Mus modell
Summary
Detta protokoll presenterar ett enkelt och sammanhängande sätt att övergående upregulate en gen av intresse med modRNA efter hjärtinfarkt hos möss.
Abstract
Hjärtinfarkt (MI) är en ledande orsak till sjuklighet och dödlighet i västvärlden. Under det senaste årtiondet har genterapi blivit ett lovande behandlingsalternativ för hjärtsjukdomar, på grund av dess effektivitet och exceptionella terapeutiska effekter. I ett försök att reparera den skadade vävnaden efter MI, olika studier har använt DNA-baserade eller viral genterapi men har ställts inför betydande hinder på grund av de fattiga och okontrollerade uttryck av de levererade gener, ödem, arytmi och hjärt hypertrofi. Syntetisk modifierad mRNA (modRNA) presenterar en ny genterapi metod som erbjuder hög, övergående, säker, nonimmunogenic, och kontrollerad mRNA leverans till hjärtvävnaden utan risk för genomisk integration. På grund av dessa anmärkningsvärda egenskaper i kombination med dess klockformade farmakokinetik i hjärtat, modRNA har blivit en attraktiv metod för behandling av hjärtsjukdomar. För att öka dess effektivitet in vivo måste dock en konsekvent och tillförlitlig leveransmetod följas. Därför, för att maximera modRNA leverans effektivitet och avkastning konsekvens i modRNA användning för in vivo applikationer, en optimerad metod för beredning och leverans av modRNA intracardiac injektion i en mus MI modell presenteras. Detta protokoll kommer att göra modRNA-leverans mer tillgänglig för grundläggande och translationell forskning.
Introduction
Genterapi är ett kraftfullt verktyg som innebär leverans av nukleinsyror för behandling, botemedel eller förebyggande av mänskliga sjukdomar. Trots framstegen i diagnostiska och terapeutiska metoder för hjärtsjukdomar, det har varit begränsad framgång i leveransen av gener i hjärtinfarkt (MI) och hjärtsvikt (HF). Så enkelt som processen för genterapi verkar, är det ett markant komplext tillvägagångssätt med tanke på de många faktorer som måste optimeras innan du använder ett visst leveransfordon. Rätt leveransvektor bör vara icke-immunogen, effektiv och stabil inuti människokroppen. Insatser på detta område har genererat två typer av leveranssystem: viral eller icke-viral. De allmänt använda virussystemen, inklusive genöverföring av adenovirus, retrovirus, lentivirus eller adeno-associerade virus, har visat exceptionell transduktionskapacitet. Emellertid, deras användning på kliniker är begränsad på grund av det starka immunsvaret inducerad1, risk för tumorigenesis2, eller förekomsten av neutraliserande antikroppar3, som alla förblir ett stort hinder för bred och effektiv tillämpning av viral vektorer i mänskliga genterapi. Å andra sidan, trots deras imponerande uttryck mönster, leverans av nakna plasmid DNA visar en låg transfection effektivitet, medan mRNA överföring presenterar hög immunogenicitet och känslighet för nedbrytning av RNase4.
Med den omfattande forskningen inom mRNA har modRNA blivit ett attraktivt verktyg för leverans av gener till hjärtat och olika andra organ på grund av dess många fördelar jämfört med traditionella vektorer5. Fullständig ersättning av uridin med naturligt förekommande pseudouridin resulterar i mer robust och övergående proteinuttryck, med minimal induktion av medfödd immunsvar och risk för genomisk integration6. Nyligen etablerade protokoll använder en optimerad mängd anti-reverse cap analog (ARCA) som ytterligare förbättrar proteinöversättningen genom att öka stabiliteten och transabilityen hos den syntetiska mRNA7.
Tidigare rapporter har visat uttryck för olika reporter eller funktionella gener levereras av modRNA i gnagare hjärtmuskeln efter MI. Med modRNA applikationer, betydande områden av hjärtmuskeln, inklusive både kardiomyocyter och noncardiomyocytes, har framgångsrikt transfected post-hjärt skada8 att inducera angiogenes9,10, hjärtcell överlevnad11, och kardiomyocyte spridning12. En enda administrering av modRNA kodade för muterade mänskliga follistatin-liknande 1 inducerar spridningen av mus vuxna CMs och avsevärt ökar hjärtfunktion, minskar ärr storlek, och ökar kapillärdensitet 4 veckor efter MI12. En nyare studie rapporterade förbättrad hjärtfunktion efter MI med tillämpning av VEGFA modRNA i en svin modell10.
Således, med den ökade populariteten av modRNA i hjärtfältet, är det viktigt att utveckla och optimera ett protokoll för leverans av modRNA till hjärtat post-MI. Herein är ett protokoll som beskriver beredning och leverans av renad och optimerad modRNA i en biokompatibel citrat-saltlösning formulering som ger robust, stabilt protein uttryck utan att stimulera något immunsvar. Den metod som visas i detta protokoll och video visar standard kirurgiska ingrepp av en mus MI av permanent ligering av den vänstra främre fallande gatan (LAD), följt av tre plats intracardiac injektioner av modRNA. Syftet med detta dokument är att tydligt definiera en mycket exakt och reproducerbar metod för modRNA leverans till murine hjärtmuskeln för att göra modRNA ansökan allmänt tillgänglig för hjärt genterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genterapi har visat en enorm potential att avsevärt främja behandling av hjärtsjukdom. Emellertid, traditionella verktyg som används i de inledande kliniska prövningarna för behandling av HF har visat begränsad framgång och är associerade med allvarliga biverkningar. Modifierad RNA presenterar en icke-viral genleverans som ständigt ökar i popularitet som ett genöverföringsverktyg i hjärtat. ModRNA kräver ingen kärnlokalisering av gener för översättning, och erbjuder därmed ett effektivt och snabbt utt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Ann Anu Kurian för hennes hjälp med detta manuskript. Detta arbete finansierades av ett kardiologistartsbidrag som beviljats Zangilaboratoriet och även av NIH-stipendiet R01 HL142768-01
Materials
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
- Muruve, D. A. The innate immune response to adenovirus vectors. Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).
- Donsante, A., et al. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).
- Calcedo, R., Wilson, J. M. Humoral Immune Response to AAV. Frontiers in Immunology. 4, 341 (2013).
- Diebold, S. S., et al. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).
- Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart. Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).
- Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
- Hadas, Y., et al. Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy. Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).
- Sultana, N., et al. Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA. Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Carlsson, L., et al. Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine. Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).
- Huang, C. L., et al. Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction. Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).
- Magadum, A., et al. Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).
- Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery. Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).
- Gan, L. M., et al. Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes. Nature Communication. 10 (1), 871 (2019).
