Entrega de ARNm modificado en un modelo de ratón de infarto de miocardio
Summary
Este protocolo presenta una manera simple y coherente de regular transitoriamente un gen de interés utilizando modRNA después del infarto de miocardio en ratones.
Abstract
El infarto de miocardio (MI) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo occidental. En la última década, la terapia génica se ha convertido en una opción de tratamiento prometedor para las enfermedades cardíacas, debido a su eficiencia y efectos terapéuticos excepcionales. En un esfuerzo por reparar el tejido dañado después de la MI, varios estudios han empleado terapia génica viral o basada en el ADN, pero han enfrentado obstáculos considerables debido a la expresión pobre e incontrolada de los genes entregados, edema, arritmia e hipertrofia cardíaca. El ARNm modificado sintético (MODRNA) presenta un novedoso enfoque de terapia génica que ofrece un suministro de ARNm alto, transitorio, seguro, no nommunogénico y controlado al tejido cardíaco sin ningún riesgo de integración genómica. Debido a estas características notables combinadas con su farmacocinética en forma de campana en el corazón, modRNA se ha convertido en un enfoque atractivo para el tratamiento de enfermedades del corazón. Sin embargo, para aumentar su eficacia in vivo, es necesario seguir un método de entrega coherente y fiable. Por lo tanto, para maximizar la eficiencia de la entrega de modRNA y la consistencia del rendimiento en el uso de modRNA para aplicaciones in vivo, se presenta un método optimizado de preparación y entrega de la inyección intracardiaca modRNA en un modelo MI de ratón. Este protocolo hará que la entrega de modRNA sea más accesible para la investigación básica y traslacional.
Introduction
La terapia génica es una poderosa herramienta que implica la administración de ácidos nucleicos para el tratamiento, cura o prevención de enfermedades humanas. A pesar de los avances en los enfoques diagnósticos y terapéuticos para las enfermedades cardíacas, ha habido un éxito limitado en la administración de genes en el infarto de miocardio (MI) y la insuficiencia cardíaca (HF). Tan sencillo como parece el proceso de la terapia génica, es un enfoque marcadamente complejo teniendo en cuenta los muchos factores que deben optimizarse antes de emplear un vehículo de entrega en particular. El vector de administración correcto debe ser no inmunogénico, eficiente y estable dentro del cuerpo humano. Los esfuerzos en este campo han generado dos tipos de sistemas de administración: viral o no viral. Los sistemas virales ampliamente utilizados, incluida la transferencia de genes por adenovirus, retrovirus, lentivirus o virus asociados al adeno, han demostrado una capacidad de transducción excepcional. Sin embargo, su uso en clínicas es limitado debido a la fuerte respuesta inmune inducida1, riesgo de tumorigenesis2, o la presencia de anticuerpos neutralizantes3, todos los cuales siguen siendo un obstáculo importante para la aplicación amplia y eficaz de vectores virales en la terapia génica humana. Por otro lado, a pesar de su impresionante patrón de expresión, la entrega de ADN plásmido desnudo muestra una baja eficiencia de transfección, mientras que la transferencia de ARNm presenta una alta inmunogenicidad y susceptibilidad a la degradación por RNase4.
Con la extensa investigación en el campo del ARNm, modRNA se ha convertido en una herramienta atractiva para la entrega de genes al corazón y varios otros órganos debido a sus numerosas ventajas sobre los vectores tradicionales5. La sustitución completa de la uridina por pseudouridina de origen natural da como resultado una expresión proteica más robusta y transitoria, con una inducción mínima de la respuesta inmunitaria innata y el riesgo de integración genómica6. Los protocolos recientemente establecidos utilizan una cantidad optimizada de análogo de tapa antirrevertida (ARCA) que mejora aún más la traducción de proteínas al aumentar la estabilidad y transabilidad del ARNm sintético7.
Informes anteriores han mostrado la expresión de varios genes reporteros o funcionales entregados por modRNA en el miocardio de roedores después de MI. Con las aplicaciones de modRNA, áreas significativas del miocardio, incluyendo tanto cardiomiocitos como nocardiomiocitos, han sido trans infectadas con éxito lesión post-cardiaca8 para inducir la angiogénesis9,10, supervivencia de células cardíacas11, y la proliferación de cardiomiocitos12. Una sola administración de modRNA codificado para la follistatina humana mutada-como 1 induce la proliferación de CM adultos de ratón y aumenta significativamente la función cardíaca, disminuye el tamaño de la cicatriz, y aumenta la densidad capilar 4 semanas después de MI12. Un estudio más reciente reportó mejor función cardíaca después de MI con la aplicación de VEGFA modRNA en un modelo de cerdo10.
Por lo tanto, con la mayor popularidad del modRNA en el campo cardíaco, es esencial desarrollar y optimizar un protocolo para la entrega de modRNA al corazón post-MI. Aquí es un protocolo que describe la preparación y entrega de modRNA purificado y optimizado en una formulación biocompatible citrato-salina que proporciona una expresión de proteína robusta y estable sin estimular ninguna respuesta inmune. El método mostrado en este protocolo y vídeo demuestra el procedimiento quirúrgico estándar de un MI de ratón por ligación permanente de la arteria descendente anterior izquierda (LAD), seguido de tres inyecciones intracardiacas del sitio de modRNA. El objetivo de este artículo es definir claramente un método altamente preciso y reproducible de administración de modRNA al miocardio murino para hacer que la aplicación modRNA sea ampliamente accesible para la terapia génica cardíaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
La terapia génica ha demostrado un enorme potencial para avanzar significativamente en el tratamiento de la enfermedad cardíaca. Sin embargo, herramientas tradicionales empleadas en los ensayos clínicos iniciales para el tratamiento de la IC han demostrado un éxito limitado y están asociadas con efectos secundarios graves. El ARN modificado presenta un suministro de genes no virales que está ganando popularidad continuamente como herramienta de transferencia de genes en el corazón. ModRNA no requiere localización…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen a Ann Anu Kurian por su ayuda con este manuscrito. Este trabajo fue financiado por una beca de puesta en marcha de cardiología otorgada al laboratorio Zangi y también por la subvención DE NIH R01 HL142768-01
Materials
| Adenosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289L | |
| Anti-reverse cap analog, 30-O-Mem7G(50) ppp(50)G | TriLink Biotechnologies | N-7003 | |
| Bioluminescense imaging system | Perkin Elmer | 124262 | IVIS100 charge-coupled device imaging system |
| Blunt retractors | FST | 18200-09 | |
| Cardiac tropnin I | Abcam | 47003 | |
| Cytidine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Dual Anesthesia System | Harvard Apparatus | 75-2001 | |
| Forceps- Adson | FST | 91106-12 | |
| Forceps- Dumont #7 | FST | 91197-00 | |
| Guanosine triphosphate | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| In vitro transcription kit | Invitrogen | AMB13345 | 5X MEGAscript T7 Kit |
| Intubation cannula | Harvard Apparatus | ||
| Megaclear kit | Life Technologies | ||
| Mouse ventilator | Harvard Apparatus | 73-4279 | |
| N1-methylpseudouridine-5-triphosphate | TriLink Biotechnologies | N-1081 | |
| NanoDrop Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Olsen hegar needle holder with suture scissors | FST | 12002-12 | |
| Plasmid templates | GeneArt, Thermo Fisher Scientific | ||
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | FST | 14200-12 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Sutures | Ethicon | Y433H | 5.00 |
| Sutures | Ethicon | Y432H | 6.00 |
| Sutures | Ethicon | 7733G | 7.00 |
| T7 DNase enzyme | Invitrogen | AMB13345 | Included in Megascript kit |
| Tape station | Aligent | 4200 | |
| Transcription clean up kit | Invitrogen | AM1908 | Megaclear |
| Ultra-4 centrifugal filters 10k | Amicon | UFC801096 |
References
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