Différenciation efficace des neurones sympathiques postganglioniques utilisant des cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de culture sans alimentation et définies chimiquement
Summary
Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie de différenciation stable et très efficace pour la génération de neurones sympathiques postganglioniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Ce modèle rendra les neurones disponibles pour l’utilisation d’études sur de multiples troubles autonomes.
Abstract
Les cellules souches pluripotentes humaines (HPSCs) sont devenues un outil puissant pour la modélisation des maladies et l’étude du développement embryonnaire humain in vitro. Nous avons précédemment présenté un protocole de différenciation pour la dérivation des neurones autonomes avec le caractère sympathique qui a été appliqué aux patients présentant la neuropathie autonome. Cependant, le protocole a été construit sur knock Out Serum Replacement (KSR) et les conditions de culture à base d’alimentation, et pour assurer une efficacité de différenciation élevée, le tri cellulaire était nécessaire. Ces facteurs causent une grande variabilité, un coût élevé et une faible reproductibilité. En outre, les propriétés sympathiques matures, y compris l’activité électrique, n’ont pas été vérifiées. Ici, nous présentons un protocole optimisé où la culture et la différenciation de la CFP sont exécutées dans des conditions de culture sans conducteur et définies chimiquement. Des marqueurs génétiques identifiant la crête neurale de tronc sont identifiés. Une autre différenciation dans les neurones sympathiques postganglioniques est réalisée après 20 jours sans avoir besoin de tri cellulaire. L’enregistrement électrophysiologique montre davantage l’identité fonctionnelle des neurones. La cuisson détectée de nos neurones différenciés peut être améliorée par la nicotine et supprimée par le propranolol antagoniste de récepteur adrénergique. Les progéniteurs neuronaux sympathiques intermédiaires dans ce protocole peuvent être maintenus comme sphéroïdes neuraux pendant jusqu’à 2 semaines, ce qui permet l’expansion des cultures. En somme, notre protocole de différenciation des neurones sympathique mis à jour montre une grande efficacité de différenciation, une meilleure reproductibilité, plus de flexibilité et une meilleure maturation neuronale par rapport à la version précédente. Ce protocole fournira aux chercheurs les cellules nécessaires à l’étude des troubles humains qui affectent le système nerveux autonome.
Introduction
Les neurones sympathiques postganglioniques (symNs) appartiennent au système nerveux autonome (ANS) et ont des rôles importants multiples dans la réponse et la régulation de l’homéostasie du corps indépendant de la conscience. Par exemple, le stress stimule les symNs et évoque la réponse de combat ou de fuite qui conduit à une augmentation de la fréquence cardiaque, de la pression artérielle et de la transpiration. Les SymNs sont affectés dans de multiples troubles humains dus à la génétique, à la toxicité/blessure, ou comme compagnons d’autres maladies. Un exemple d’une neuropathie génétique est le trouble de l’enfance Dysautonomia familiale (FD), où une dysrégulation sévère de symNs provoque une crise dysautonomique, évident par la transpiration, l’taches de la peau, les crises de vomissements, l’hypertension, et l’anxiété1. Un exemple de toxicité est le traitement de chimiothérapie, qui a été rapporté pour avoir des effets secondaires toxiques sur les neurones autonomes2. On sait que la dénervation autonome et l’hyper-innervation peuvent à la fois conduire à, ou accompagner, des maladies telles que la maladie de Parkinson ou la maladie rénale hypertendue3,4. Ainsi, être capable de mener des recherches et de comprendre les mécanismes de la biologie symN et des défauts dans le contexte de la maladie est bénéfique pour la recherche de traitements nouveaux et efficaces.
Anatomie
Le système nerveux périphérique se ramifie en divisions sensorielles et autonomes. Les nerfs afférents du système nerveux sensoriel sont responsables de la sensation de douleur et de toucher, tandis que l’ANS est responsable du relais des informations de tous les organes au cerveau. L’ANS est divisé en système nerveux entérique, innervant le tractus gastro-intestinal, le système nerveux parasympathique, qui est important pour la relaxation, et le système nerveux sympathique (SNS), qui est important pour l’activation /régulation des organes. Le SNS adapte un système bi-neurones5. Axones neuronaux sympathiques preganglionic dans la moelle épinière premier projet aux ganglions sympathiques, où les corps postganglioniques de cellules symN sont situés. Ces neurones envoient ensuite de longues projections pour innervate les tissus cibles de chaque organe dans le corps. Les signaux transmis par les neurones préganglioniques sont cholinergiques, tandis que les symns postganglioniques sont adrénergiques et expriment ainsi la noradrénaline (NE) comme leur neurotransmetteur principal. Il y a peu d’exceptions notables des neurones postganglioniques et sympathiques qui sont cholinergiques, y compris ceux qui innervent les vaisseaux sanguins. Les neurones postganglioniques adrénergiques expriment les enzymes tyrosine hydroxylase (TH), l’acide l-amino aromatique decarboxylase (AAAD), la dopamine -hydroxylase (DBH), et l’oxidase monoamine (MAO-A), tous responsables de la production et de la métabolisation de l’ONE. En outre, ils expriment les transporteurs de recyclage NE et/ou les récepteurs des récepteurs adrénergiques (ADRA2), des récepteurs adrénergiques (ADR2B), du transporteur de noradrénaline (NET1) et du transporteur de monoamines vésiculaires (VMAT1/2).
Développement
Pendant le développement embryonnaire, les symNs sont dérivés de la crête neurale (NC), qui émerge entre le tube neural et l’ectoderme6,et peut se différencier en lignées cellulaires multiples, y compris les mélanocytes, les ostéoblastes, les adipocytes, les glia, les neurones entériques, les neurones sensoriels et les neurones autonomes7. Les cellules de crête neurale (CNC) sont des cellules très migratrices qui empruntent plusieurs voies à travers l’embryon. À ce stade précoce du développement NC, les cellules expriment les marqueurs SNAIL1/2, FOXD3, et SOX108,9,10,11. La route de migration ainsi que l’emplacement axial qu’ils adoptent détermine le sous-type NC dans lequel ils se développeront. Ces sous-types NC peuvent être distingués par leur expression génétique HOX spécifique : Les CCN cranial n’expriment pas les gènes HOX, les CCN vagals expriment HOX 1-5, les CCN du tronc expriment HOX 6-9, et les CCN sacraux expriment HOX 10-1112. Parmi eux, les CCN sont reconnus comme la principale source de symNs. Les précurseurs SymN expriment le facteur de transcription MASH1/ASCL113, qui favorise l’expression de PHOX2B14 et INSM115. La famille GATA des facteurs de transcription s’exprime au cours du développement compréhensif tardif. GATA2 et GATA3 sont exprimés dans les symNs, qui active à leur tour DBH16. Le facteur de transcription HAND2 est également important pour l’expression et l’entretien de DBH et TH17.
Les CHSC (p. ex., cellules souches pluripotentes embryonnaires et induites) sont un outil puissant18 pour récapituler les paradigmes du développement et générer des symNs qui peuvent ensuite être utilisés pour la modélisation des maladies de divers troubles humains. Ainsi, tout en générant des symns à partir de HPSCs, il est crucial de suivre les lignes directrices sur le développement et d’évaluer l’expression de marqueurs appropriés le long du processus de différenciation.
Protocole symN précédent
Peu de groupes de recherche ont déjà signalé la génération de symNs à partir de hPSCs19,20,21. La comparaison directe de ces protocoles les uns aux autres et les nôtres a été revue récemment22. En 201623, nous avons publié un protocole de différenciation pour la génération de neurones autonomes au caractère symN (figure 1A). Ce protocole a utilisé le milieu à base de KSR, qui a été utilisé à la fois dans le maintien des HPSCs indifférents et la différenciation cellulaire. En outre, les HPSCs ont été maintenus sur les fibroblastes embryonnaires de souris (cellules d’alimentation de MEF). Nous avons employé ce protocole et les CFP de patients présentant FD pour modéliser le désordre23. En 2019, nous avons décrit une version plus détaillée de cet ancien protocole24. En résumé, le destin neuronal a été induit par l’inhibition double de SMAD25 pour bloquer la signalisation TGF-MD et BMP dans les 2 premiers jours. L’activation WNT utilisant CHIR99021 a encouragé les progéniteurs neuraux à devenir des cellules NC. Le jour 11, les cellules ont été triées par FACS pour les populations CD49D+ ou SOX10, 26,23, qui ont donné environ 40% d’efficacité de génération NC. Ainsi, le tri était nécessaire pour assurer l’efficacité et la pureté pour les prochaines étapes de la différenciation. Les CCN ont été maintenus et amplifiés comme sphéroïdes avec le traitement combiné de FGF2 et de CHIR. Après 4 jours, les sphéroïdes NC de l’entretien ont été plaqués et donnés BDNF, GDNF, et NGF pour terminer la maturation symN. Bien que ces symN aient exprimé de forts marqueurs symN tels que ASCL1, TH, DBH et PHOX2A, les marqueurs pour des symns plus matures, y compris l’expression du récepteur nicotinique d’acétylcholine (CHRNA3/CHRNB4) et du transporteur de vésicule (VMAT1/2), étaient bas même après 70 jours de différenciation. Les gènes HOX dans ce protocole n’ont pas été formellement testés, et les propriétés neurales matures, y compris l’activité électrophysiologique des cellules, n’ont pas été vérifiées.
Ici, nous présentons un protocole optimisé pour générer des symNs (figure 1B). Les SHC sont maintenus dans des conditions sans conducteur, sur des plats enrobés de vitronectine (VTN), à l’aide du média Essential 8 (E8)27. La formule des supports de différenciation a été modifiée à chaque étape, augmentant ainsi le pourcentage de la populationNC 28. La maturation symN peut être effectuée sur CD49Det/SOX10, en vrac triés ou non triés.+ Les deux montrent des niveaux élevés d’expression de marqueur symN par jour 30. En outre, les symNs générés avec ce protocole sont sensibles à l’enregistrement électrophysiologique et aux traitements avec des composés d’activateur et d’inhibiteur symN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons récemment publié deux examens, l’un traitant de l’utilisation de symNs dérivés du HPSC pour la modélisation des maladies31 ainsi qu’une comparaison approfondie des protocoles de différenciation disponibles22. Ainsi, nous nous concentrons ici sur le dépannage du protocole actuel pour aider le chercheur intéressé à réussir à faire des symN. Pendant tout le processus de différenciation, afin d’obtenir des données cohérentes ainsi que des cellu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Heidi Ulrichs pour la lecture critique et l’édition du manuscrit.
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
References
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