फीडर-मुक्त और रासायनिक रूप से परिभाषित संस्कृति स्थितियों के तहत मानव Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग करपोस्टाग्लियन सहानुभूति न्यूरॉन्स के कुशल भेदभाव
Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से postganglionic सहानुभूति न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए एक स्थिर, अत्यधिक कुशल भेदभाव रणनीति का वर्णन करते हैं । यह मॉडल कई स्वायत्त विकारों के अध्ययन के उपयोग के लिए न्यूरॉन्स उपलब्ध कराएगा।
Abstract
मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) रोग मॉडलिंग और विट्रो में मानव भ्रूण विकास के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गए हैं । हमने पहले स्वायत्तन्यूरोपैथी वाले रोगियों पर लागू किए गए सहानुभूति चरित्र के साथ स्वायत्त न्यूरॉन्स के व्युत्पन्न के लिए एक विभेदन प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया था। हालांकि, प्रोटोकॉल नॉक आउट सीरम रिप्लेसमेंट (KSR) और फीडर आधारित संस्कृति की स्थिति पर बनाया गया था, और उच्च भेदभाव दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, सेल छंटाई आवश्यक था। ये कारक उच्च परिवर्तनशीलता, उच्च लागत और कम प्रजनन क्षमता का कारण बनते हैं। इसके अलावा, विद्युत गतिविधि सहित परिपक्व सहानुभूति गुणों का सत्यापन नहीं किया गया है। यहां, हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जहां फीडर-मुक्त और रासायनिक रूप से परिभाषित संस्कृति स्थितियों में पीएससी संस्कृति और भेदभाव किया जाता है। ट्रंक तंत्रिका शिखर की पहचान करने वाले आनुवंशिक मार्कर की पहचान की जाती है। पोस्टगैंगलियनिक सहानुभूति न्यूरॉन्स में आगे भेदभाव सेल छंटाई की आवश्यकता के बिना 20 दिनों के बाद प्राप्त किया जाता है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग आगे कार्यात्मक न्यूरॉन पहचान को दर्शाती है। हमारे विभेदित न्यूरॉन्स से पता चला फायरिंग निकोटीन द्वारा बढ़ाया जा सकता है और एड्रेनेर रिसेप्टर विरोधी प्रोप्रानोल द्वारा दबाया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में मध्यवर्ती सहानुभूति तंत्रिका जनकों को 2 सप्ताह तक तंत्रिका स्फेरॉइड के रूप में बनाए रखा जा सकता है, जो संस्कृतियों के विस्तार की अनुमति देता है। संक्षेप में, हमारा अद्यतन सहानुभूति न्यूरॉन विभेदन प्रोटोकॉल पिछले संस्करण की तुलना में उच्च भेदभाव दक्षता, बेहतर प्रजनन क्षमता, अधिक लचीलापन और बेहतर तंत्रिका परिपक्वता दिखाता है। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को स्वायत्त तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करने वाले मानव विकारों का अध्ययन करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं के साथ प्रदान करेगा।
Introduction
पोस्टगैंगलियनसहानुभूति न्यूरॉन्स (symNs) स्वायत्त तंत्रिका तंत्र (ANS) से संबंधित हैं और चेतना से स्वतंत्र शरीर के होमोस्टोसिस का जवाब देने और विनियमन करने में कई महत्वपूर्ण भूमिकाएं हैं। उदाहरण के लिए, तनाव symNs को उत्तेजित करता है और लड़ाई या उड़ान प्रतिक्रिया है कि दिल की दर, रक्तचाप, और पसीना में वृद्धि की ओर जाता है उदाहरण भी देते हैं । आनुवंशिकी, विषाक्तता/चोट, या अन्य रोगों के साथी के रूप में कई मानव विकारों में SymNs प्रभावित होते हैं । एक आनुवंशिक न्यूरोपैथी का एक उदाहरण बचपन विकार पारिवारिक डिस्कोसिया (एफडी) है, जहां सिम्स का एक गंभीर डिस्रेगुलेशन डिस्स्वायत्त संकट का कारण बनता है, जो पसीना, त्वचा के दाग, उल्टी हमलों, उच्च रक्तचाप और चिंता1से स्पष्ट होता है। विषाक्तता का एक उदाहरण कीमोथेरेपी उपचार है, जो स्वायत्त न्यूरॉन्स2पर विषाक्त दुष्प्रभाव होने की सूचना दी गई है । यह ज्ञात है कि स्वायत्त दरिवता और हाइपर-इनरवेशन दोनों पार्किंसंस रोग या उच्च रक्तचाप गुर्दे की बीमारी3,,4जैसी बीमारियों का कारण बन सकते हैं। इस प्रकार, अनुसंधान का संचालन करने और बीमारी के संदर्भ में साइएमएन जीव विज्ञान और दोषों के तंत्र को समझने में सक्षम होना उपन्यास और प्रभावी उपचारों की खोज के लिए फायदेमंद है।
एनाटॉमी
परिधीय तंत्रिका तंत्र शाखाओं संवेदी और स्वायत्त विभाजन में। संवेदी तंत्रिका तंत्र की संबद्ध तंत्रिकाएं दर्द और स्पर्श की अनुभूति के लिए जिम्मेदार हैं, जबकि एएसएस सभी अंगों से मस्तिष्क तक जानकारी को रिले करने के लिए जिम्मेदार है। एएनएस को आंत्र तंत्रिका तंत्र में विभाजित किया गया है, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट, पैरापेनुसी तंत्रिका तंत्र, जो विश्राम के लिए महत्वपूर्ण है, और सहानुभूति तंत्रिका तंत्र (एसएनएस), जो अंगों के सक्रियण/विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है। एसएनएस एक दो न्यूरॉन प्रणाली5अनुकूलित करता है । रीढ़ की हड्डी में Preganglionic सहानुभूति तंत्रिका axons सहानुभूति गंगलिया, जहां postganglionic symN सेल निकायों स्थित है के लिए पहली परियोजना । इसके बाद ये न्यूरॉन्स शरीर के हर अंग के लक्षित ऊतकों को इनरवेट करने के लिए लंबे अनुमान भेजते हैं। प्रीगैग्लियोटिक न्यूरॉन्स द्वारा प्रेषित संकेत कोलिनेर्गिक होते हैं, जबकि पोस्टगैग्लियोटिक सिमेंस एड्रेनेस होते हैं और इस प्रकार उनके मुख्य न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में नोरेपिनेफ्रीन (एनई) को व्यक्त करते हैं। पोस्टगैंगलियनिक, सहानुभूति न्यूरॉन्स के कुछ उल्लेखनीय अपवाद हैं जो कोलिनेर्गिक हैं, जिनमें रक्त वाहिकाओं को आंतरिक बनाना शामिल है। एड्रेनेर्गिक पोस्टगैग्लियोटिक न्यूरॉन्स एंजाइमों टायरोसिन हाइड्रोक्साइल (टीएच), सुगंधित एल-अमीनो एसिड डिकार्बोक्सिलास (एएएडी), डोपामाइन-हाइड्रोक्साइल (डीबीएच), और मोनोमाइन ऑक्सीडेस (माओ-ए) को व्यक्त करते हैं, जो एनई को पैदा करने और मेटाबोलाइज करने के लिए जिम्मेदार हैं। इसके अलावा, वे एनई रीसाइक्लिंग ट्रांसपोर्टरों और/या रिसेप्टर्स α-एड्रेनेर्गिक रिसेप्टर (ADRA2), एड्रेनेर रिसेप्टर (ADR2B), नोरेनिनेफ्रीन ट्रांसपोर्टर (NET1), और वेसिकुलर मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर (VMAT1/2) को व्यक्त करते हैं ।
विकास
भ्रूण विकास के दौरान सिम्न तंत्रिका शिखर (नेकां) से प्राप्त होते हैं, जो तंत्रिका ट्यूब और ओवरलेलिंग एक्टोडर्म6के बीच उभरते हैं, और मेलानोसाइट्स, ऑस्टियोब्लास्ट, आदिपोसाइट्स, ग्लिया, एंटिक न्यूरॉन्स, संवेदी न्यूरॉन्स और स्वायत्त न्यूरॉन्स7सहित कई सेल वंशों में अंतर कर सकते हैं। तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाएं (एनसीसी) अत्यधिक प्रवासी कोशिकाएं हैं जो भ्रूण के माध्यम से कई मार्ग लेती हैं। नेकां के विकास के इस प्रारंभिक चरण में, कोशिकाएं मार्कर घोंघा 1/2, FOXD3 और SOX108,,9,,10,,11को व्यक्त करती हैं। प्रवास मार्ग उनके द्वारा अपनाए जाने वाले अक्षीय स्थान के साथ मिलकर एनसी उपप्रकार निर्धारित करता है जिसमें वे विकसित होंगे। इन नेकां उपप्रकारों को उनके विशिष्ट HOX जीन अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है: कपाल एनसीसी होएक्स जीन, वागल एनसीसी एक्सप्रेस HOX 1-5, ट्रंक एनसीसी एक्सप्रेस HOX 6-9, और पवित्र एनसीसी एक्सप्रेस HOX 10-1112व्यक्त नहीं करते हैं। उनमें से, ट्रंक एनसीसी को सिमिन्स के मुख्य स्रोत के रूप में पहचाना जाता है। सिम्न अग्रदूत प्रतिलेखन कारक MASH1/ASCL113को व्यक्त करते हैं, जो PHOX2B14 और INSM115की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है । ट्रांसक्रिप्शन कारकों का गेटा परिवार देर से सहानुभूतिपूर्ण विकास के दौरान व्यक्त किया जाता है। GATA2 और GATA3 symNs में व्यक्त कर रहे हैं, जो बदले में DBH16सक्रिय । डीबीएच और टीएच17की अभिव्यक्ति और रखरखाव के लिए ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर हैंड2 भी महत्वपूर्ण है ।
एचपीएससी (उदाहरण के लिए, भ्रूणीय और प्रेरित प्लुरीटेंट स्टेम सेल) विकासात्मक प्रतिमानों को फिर से तैयार करने और सिमेंस उत्पन्न करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण18 हैं जिन्हें विभिन्न मानव विकारों के रोग मॉडलिंग के लिए नियोजित किया जा सकता है। इस प्रकार, एचपीएससी से साइमेंस उत्पन्न करते समय, विकासात्मक दिशा-निर्देशों का पालन करना और भेदभाव प्रक्रिया के साथ उचित मार्कर की अभिव्यक्ति का आकलन करना महत्वपूर्ण है।
पिछला सिमिन प्रोटोकॉल
कुछ शोध समूहों ने पहले एचपीएससी19,20,,21से साइमेंस की पीढ़ी की सूचना दी है । इन प्रोटोकॉलों की सीधी तुलना एक-दूसरे और हमारी ओर से हाल ही में22की समीक्षा की गई थी . 201623में, हमने सिमिन चरित्र(चित्रा 1ए)के साथ स्वायत्त न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए एक विभेदन प्रोटोकॉल प्रकाशित किया। इस प्रोटोकॉल में केएसआर आधारित माध्यम का उपयोग किया गया था, जिसका उपयोग अविभेदित एचपीएससी और सेल विभेदन दोनों के रखरखाव में किया गया था। इसके अलावा, चूहे भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ फीडर कोशिकाओं) पर एचसीपीसी बनाए रखा गया था। हमने इस प्रोटोकॉल और पीएससी को एफडी वाले रोगियों से23विकार को मॉडल करने के लिए नियोजित किया । 2019 में, हमने इस पुराने प्रोटोकॉल24का अधिक विस्तृत संस्करण वर्णित किया। संक्षेप में, तंत्रिका भाग्य को पहले 2 दिनों में टीजीएफ-एऔर बीएमपी सिग्नलिंग को ब्लॉक करने के लिए दोहरी SMAD अवरोध25 द्वारा प्रेरित किया गया था। CHIR99021 का उपयोग कर WNT सक्रियण तंत्रिका जनकों को पदोन्नत करने के लिए नेकां कोशिकाओं बन जाते हैं । 11 दिन, कोशिकाओं को सीडीएस 49डी+ या SOX10+ आबादी26,,23के लिए FACS द्वारा हल किया गया, जिससे लगभग 40% नेकां उत्पादन दक्षता मिली। इस प्रकार, भेदभाव के अगले चरणों के लिए दक्षता और शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए छंटाई की आवश्यकता थी। एनसीसी को एफजीएफ2 और चिर के संयुक्त उपचार के साथ स्फेरॉइड के रूप में बनाए रखा गया और परिलक्षित किया गया। 4 दिनों के बाद, रखरखाव के एनसी स्फेरॉइड को चढ़ाया गया और सीपीएन परिपक्वता को समाप्त करने के लिए बीडीएनएफ, जीडीएनएफ और एनजीएफ दिया गया। हालांकि इन symNs ऐसे ASCL1, TH, DBH, और PHOX2A के रूप में मजबूत symN मार्कर व्यक्त की, अधिक परिपक्व symNs के लिए मार्कर, निकोटीनिक acetylcholine रिसेप्टर (CHRNA3/CHRNB4) और वेसिकल ट्रांसपोर्टर (VMAT1/2) की अभिव्यक्ति सहित, भेदभाव के ७० दिनों के बाद भी कम थे । इस प्रोटोकॉल में HOX जीन औपचारिक रूप से परीक्षण नहीं किया गया था, और कोशिकाओं की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गतिविधि सहित परिपक्व तंत्रिका गुणों, सत्यापित नहीं थे ।
यहां, हम सिमेंस(चित्रा 1B)उत्पन्न करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एचपीएससी को फीडर-फ्री स्थितियों में, विट्रोनेक्टिन (वीटीएन) -लेपित व्यंजनों पर बनाए रखा जाता है, जो आवश्यक 8 (ई8) मीडिया27का उपयोग करके। विभेदन मीडिया के फार्मूले को प्रत्येक चरण में संशोधित किया गया है, जिससे नेकां की जनसंख्या28का प्रतिशत बढ़ गया है । symN परिपक्वता CD49D+/SOX10+ हल या अक्रमित थोक एनसीसी आबादी पर किया जा सकता है । दोनों 30 दिन तक साइएमएन मार्कर अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को दिखाते हैं । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न सिमेंस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग और सिमिन एक्टिवेटर और अवरोधक यौगिकों के साथ उपचार के लिए उत्तरदायी हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने हाल ही में दो समीक्षाएं प्रकाशित की हैं, जिनमें से एक रोग मॉडलिंग31 के लिए एचपीएससी-व्युत्पन्न सिमन के उपयोग के साथ-साथ उपलब्ध विभेदन प्रोटोकॉल22की गहराई से तुलना करने पर चर्चा कर ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और संपादन के लिए हीदी उल्रिच का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
References
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