Differenziazione efficiente dei neuroni simpatici postganglionici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente
Summary
In questo protocollo, descriviamo una strategia di differenziazione stabile e altamente efficiente per la generazione di neuroni simpatici postganglionici dalle cellule staminali pluripotenti umane. Questo modello renderà i neuroni disponibili per l’uso di studi di disturbi autonomici multipli.
Abstract
Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono diventate un potente strumento per la modellazione della malattia e lo studio dello sviluppo embrionale umano in vitro. In precedenza abbiamo presentato un protocollo di differenziazione per la derivazione dei neuroni autonomi con carattere simpatico che è stato applicato ai pazienti con neuropatia autonomica. Tuttavia, il protocollo è stato costruito su Knock Out Serum Replacement (KSR) e sulle condizioni di coltura basate sull’alimentatore, e per garantire un’elevata efficienza di differenziazione, lo smistamento cellulare era necessario. Questi fattori causano un’elevata variabilità, costi elevati e bassa riproducibilità. Inoltre, le proprietà simpatiche mature, compresa l’attività elettrica, non sono state verificate. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato in cui la cultura e la differenziazione del PSC vengono eseguite in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente. Sono identificati marcatori genetici che identificano la cresta neurale del tronco. Un’ulteriore differenziazione nei neuroni simpatici postganglionici si ottiene dopo 20 giorni senza la necessità di smistamento cellulare. La registrazione elettrofisiologica mostra ulteriormente l’identità del neurone funzionale. La cottura rilevata dai nostri neuroni differenziati può essere potenziata dalla nicotina e soppressa dall’antagonista del recettore adrenergico. I progenitori neurali simpatici intermedi in questo protocollo possono essere mantenuti come sferoidi neurali fino a 2 settimane, il che consente l’espansione delle colture. In sintesi, il nostro protocollo di differenziazione del neurone simpatico aggiornato mostra un’elevata efficienza di differenziazione, una migliore riproducibilità, una maggiore flessibilità e una migliore maturazione neurale rispetto alla versione precedente. Questo protocollo fornirà ai ricercatori le cellule necessarie per studiare i disturbi umani che colpiscono il sistema nervoso autonomo.
Introduction
I neuroni simpatici postganglionici (symN) appartengono al sistema nervoso autonomo (ANS) e hanno molteplici ruoli importanti nel rispondere e regolare l’omeostasi del corpo indipendente dalla coscienza. Ad esempio, lo stress stimola i simN ed evoca la risposta di lotta o volo che porta ad un aumento della frequenza cardiaca, della pressione sanguigna e della sudorazione. Le simn sono colpite da molteplici disturbi umani a causa di genetica, tossicità/lesioni o come compagni di altre malattie. Un esempio di neuropatia genetica è il disturbo infantile Familial Dysautonomia (FD), dove una grave disregolazione delle simile provoca crisi disautonomica, evidente sudorazione, slottatura della pelle, attacchi di vomito, ipertensione e ansia1. Un esempio di tossicità è il trattamento chemioterapico, che è stato segnalato per avere effetti collaterali tossici sui neuroni autonomici2. È noto che la denervazione autonoma e l’iperinnervazione possono sia portare, o accompagnare, malattie come il morbo di Parkinson o la malattia renale ipertensiva3,4. Pertanto, essere in grado di condurre ricerche e comprendere i meccanismi della biologia symN e dei difetti nel contesto della malattia è utile per la ricerca di trattamenti nuovi ed efficaci.
Anatomia
Il sistema nervoso periferico si dirama in divisioni sensoriali e autonomiche. I nervi afferenti del sistema nervoso sensoriale sono responsabili della sensazione di dolore e tatto, mentre l’ANS è responsabile della raccolta di informazioni da tutti gli organi al cervello. L’ANS è diviso nel sistema nervoso enterico, innervanendo il tratto gastrointestinale, il sistema nervoso parasimpatico, che è importante per il rilassamento, e il sistema nervoso simpatico (SNS), che è importante per l’attivazione / regolazione degli organi. Il SNS adatta un sistema a due neuroni5. Preganglionico simpatico assoni neurali simpatici nel primo progetto del midollo spinale ai gangli simpatici, dove si trovano i corpi cellulari symN postganglionico. Questi neuroni inviano quindi lunghe proiezioni per innervare i tessuti bersaglio di ogni organo nel corpo. I segnali trasmessi dai neuroni preganglioni sono colinergici, mentre le simpatie postganglioniche sono adrenergiche e quindi esprimono noradrenalina (NE) come neurotrasmettitore principale. Ci sono poche eccezioni notevoli di neuroni postganglionici e simpatici che sono colinergici, compresi quelli innervati vasi sanguigni. I neuroni postganglionici adrenergici esprimono gli enzisi drossidi idrossido di tirosina (TH), la decarboxylasi aromatica di amminoacido L (AAAD), la dopamina-idrossilasi (DBH) e l’ossidasi monoamina (MAO-A), tutti responsabili della generazione e della metabolizzazione di NE. Inoltre, esprimono i trasportatori NE che riciclano e/o i recettori del recettore adrenergico (ADRA2), il recettore z-adrenergico (ADR2B), il trasportatore di noradrenalina noradrenalina (NET1) e il trasportatore di monoamina vescicolare (VMAT1/2).
Sviluppo
Durante lo sviluppo embrionale i symN sono derivati dalla cresta neurale (NC), che emerge tra il tubo neurale e l’ectoderma sovrapposto6, e può differenziarsi in linee multiple cellulari, tra cui melanociti, osteoblasti, adipociti, glia, neuroni enterici, neuroni sensoriali e neuroni autonomi7 . Le cellule di cresta neurale (NCC) sono cellule altamente migratorie che prendono diverse rotte attraverso l’embrione. In questa fase iniziale dello sviluppo NC, le celle esprimono i marcatori SNAIL1/2, FOXD3 e SOX108,9,10,11. Il percorso di migrazione insieme alla posizione assiale che adottano determina il sottotipo NC in cui si svilupperanno. Questi sottotipi NC possono essere distinti per la loro specifica espressione genica HOX: le CNC craniali non esprimono geni HOX, i cCI vagali esprimono HOX 1–5, i CCI trunk esprimono HOX 6–9 e le CPC sacrali esprimono HOX 10–1112. Tra questi, le NCC trunk sono riconosciute come la principale fonte di symN. I precursori di SymN esprimono il fattore di trascrizione MASH1/ASCL113, che promuove l’espressione di PHOX2B14 e INSM115. La famiglia GATA di fattori di trascrizione è espressa durante lo sviluppo di qualsiasi simpatia tardiva. GATA2 e GATA3 sono espressi nelle simine, che a loro volta attiva NOC16. Il fattore di trascrizione HAND2 è importante anche per l’espressione e la manutenzione di DBH e TH17.
Le HPCC (ad esempio, cellule staminali pluripotenti embrionali e indotte) sono un potente strumento18 per ricapitolare i paradigmi dello sviluppo e generare simN che possono poi essere impiegati per la modellazione della malattia di vari disturbi umani. Pertanto, generando simN da hPSC, è fondamentale seguire le linee guida di sviluppo e valutare l’espressione dei marcatori appropriati lungo il processo di differenziazione.
Protocollo symN precedente
Pochi gruppi di ricerca hanno precedentemente segnalato la generazione di simN da hPSC19,20,21. Il confronto diretto di questi protocolli tra loro e il nostro è stato esaminato di recente22. Nel 201623, abbiamo pubblicato un protocollo di differenziazione per la generazione di neuroni autonomi con carattere symN (Figura 1A). Questo protocollo ha utilizzato il mezzo basato su KSR, che è stato utilizzato sia nella manutenzione di hPSC indifferenziati che nella differenziazione cellulare. Inoltre, gli hPSC sono stati mantenuti su fibroblasti embrionali di topo (cellule feeder MEF). Abbiamo impiegato questo protocollo e PSC da pazienti con FD per modellare il disturbo23. Nel 2019, abbiamo descritto una versione più dettagliata di questo protocollo precedente24. In sintesi, il destino neurale è stato indotto dalla doppia inibizione SMAD25 per bloccare la segnalazione TGF-e BMP nei primi 2 giorni. L’attivazione WNT con CHIR99021 ha promosso i progenitori neurali a diventare cellule NC. Il giorno 11, le cellule sono state ordinate da FACS per CD49D, o SOX10, popolazioni26,23, che ha prodotto circa 40% NC efficienza di generazione. Pertanto, lo smistamento era necessario per garantire l’efficienza e la purezza per le prossime fasi di differenziazione. Gli NCC sono stati mantenuti e amplificati come sferoidi con il trattamento combinato di FGF2 e CHIR. Dopo 4 giorni, gli sferoidi NC di manutenzione sono stati placcati e dato BDNF, GDNF, e NGF per completare la maturazione symN. Sebbene queste simN abbiano espresso forti marcatori simbolici come ASCL1, TH, DBH e PHOX2A, i marcatori per le simN più mature, inclusa l’espressione del recettore dell’acetilcolina nicotinica (CHRNA3/CHRNB4) e del trasportatore di vescicole (VMAT1/2), erano bassi anche dopo 70 giorni di differenziazione. I geni HOX in questo protocollo non sono stati testati formalmente e le proprietà neurali mature, compresa l’attività elettrofisiologica delle cellule, non sono state verificate.
In questo caso, presentiamo un protocollo ottimizzato per generare symN (Figura 1B). Le HPSC sono mantenute in condizioni di assenza di alimentatori, su piatti rivestiti di vitronectin (VTN), utilizzando i supporti Essential 8 (E8)27. La formula dei mezzi di differenziazione è stata modificata in ogni fase, aumentando così la percentuale della popolazione NC28. La maturazione della simN può essere eseguita su CD49D–/SOX10– popolazioni NCC di massa ordinate o non ordinate. Entrambi mostrano alti livelli di espressione del marcatore symN per giorno 30. Inoltre, i symN generati con questo protocollo sono sensibili alla registrazione elettrofisiologica e ai trattamenti con composti di attivazione e inibitori.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recentemente abbiamo pubblicato due recensioni, una che discute l’uso di symN derivati da hPSC per la modellazione delle malattie31, nonché un confronto approfondito dei protocolli di differenziazione disponibili22. Così, qui ci concentriamo sulla risoluzione dei problemi del protocollo attuale per aiutare il ricercatore interessato a riuscire a fare simN. Durante l’intero processo di differenziazione, al fine di ottenere dati coerenti e cellule differenziate sane, la con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Heidi Ulrichs per la lettura critica e l’editing del manoscritto.
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
References
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