フィーダーフリーおよび化学的に定義された培養条件下でのヒト多能性幹細胞を用いた後神経節系交感神経ニューロンの効率的な分化
Summary
本プロトコルでは、ヒト多能性幹細胞からの神経節後交感神経ニューロンの生成に対する安定した、高効率な分化戦略を説明する。このモデルは、複数の自律神経障害の研究の使用のためにニューロンを利用可能にします.
Abstract
ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、疾患のモデル化やヒト胚発生の研究に役立つツールとなっています。我々は以前、自律神経障害患者に適用された交感神経を有する自律神経ニューロンの誘導のための分化プロトコルを提示した。しかし、このプロトコルは、ノックアウト血清置換(KSR)およびフィーダーベースの培養条件に基づいて構築され、高い分化効率を確保するために、細胞のソートが必要であった。これらの要因は、高い変動性、高コスト、および低い再現性を引き起こします。また、成熟した交感神経特性は、電気的活性を含めて、検証されていない。ここでは、PSC培養と分化がフィーダーフリーで化学的に定義された培養条件で行われる最適化されたプロトコルを提示する。幹神経堤を識別する遺伝子マーカーが同定される。ポストガンリオニック交感神経ニューロンへのさらなる分化は、細胞のソートを必要とせずに20日後に達成される。電気生理学的記録は、機能的ニューロン同一性をさらに示す。我々の分化されたニューロンから検出された発火はニコチンによって増強され、アドレナリン受容体拮抗薬プロプラノロールによって抑制することができる。このプロトコルにおける中間交感神経前駆物質は、最大2週間のニューラルスフェロイドとして維持することができ、培養の拡大を可能にする。要約すると、私たちの更新された交感神経分化プロトコルは、以前のバージョンと比較して、高い分化効率、より良い再現性、より柔軟性、およびより良い神経成熟を示しています。このプロトコルは、自律神経系に影響を与える人間の障害を研究するために必要な細胞を研究者に提供します。
Introduction
神経節後交感神経ニューロン(symN)は自律神経系(ANS)に属し、意識から独立した身体の恒常性の応答および調節において複数の重要な役割を果たしています。例えば、ストレスはsymNを刺激し、心拍数、血圧、発汗の増加につながる戦いや飛行応答を呼び起こします。SymNは、遺伝学、毒性/傷害、または他の疾患の仲間として、複数のヒト障害に影響を受けます。遺伝的神経障害の一例は、小児期障害家族性自律神経障害(FD)であり、symNの重度の調節不変が自律神経障害を引き起こし、発汗、皮膚のしみ、嘔吐発作、高血圧、および不安1によって明らかである。毒性の一例は化学療法治療であり、自律神経細胞に毒性の副作用があると報告されている2.自律神経性脱化および超内腎症は、パーキンソン病または高血圧性腎疾患,3,4などの疾患に併生したり、併生したりすることが知られている。このように、疾患の文脈におけるsymN生物学や欠陥のメカニズムを研究し、理解できることは、新しい効果的な治療法の探索に有益である。
解剖 学
末梢神経系は、感覚と自律神経分裂に分岐します。感覚神経系の感覚神経は痛みや触覚の原因ですが、ANSはすべての臓器から脳への情報を中継する責任があります。ANSは腸神経系に分かれており、胃腸管を内面化し、リラクゼーションに重要な副交感神経系、および器官の活性化/調節に重要な交感神経系(SNS)に分かれています。SNSは、2ニューロンシステム5を適応させる。脊髄の前神経節交感神経軸索は、神経節後のsymN細胞体が位置する交感神経節に最初に投影される。これらのニューロンは、その後、体内のすべての臓器の標的組織を内側に向けるために長い投影を送信します。前ガングリオン性ニューロンによって伝達される信号はコリン作動性であるのに対し、ポストガングlionic symNはアドレナリン性であり、したがってノルエピネフリン(NE)を主な神経伝達物質として発現する。コリン作動性であるポストガンリオニック、交感神経ニューロンの顕著な例外はほとんどありません, 血管を内在するものを含みます.アドレナリン性ポストガングLION細胞は、酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼ(AAAD)、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ(DBH)、モノアミンオキシダーゼ(MAO-A)を発現し、NEの生成と代謝を担います。さらに、NE循環性トランスポーターおよび/または受容体αアドレナリン受容体(ADRA2)、βアドレナリン受容体(ADR2B)、ノルエピネフリントランスポーター(NET1)、およびベスキュリモノアミントランスポーター(VMAT1/2)を発現する。
開発
胚発生時にsymNは神経堤(NC)に由来し、神経管とエクトダーム6を重ね合わせ、メラノサイト、骨芽細胞、椎細胞細胞、グリア、腸腸ニューロン、感覚ニューロン、自律神経ニューロン7を含む複数の細胞系統に分化することができる。神経堤細胞(NCC)は、胚を通るいくつかの経路を取る高度に回遊性細胞である。NCの開発の初期のこの段階では、細胞はマーカーSNAIL1 / 2、FOXD3、およびSOX10898、9、10、1110,11を表します。,移行ルートと、それらが採用する軸方向の位置によって、それらが開発される NC サブタイプが決まります。これらのNCサブタイプは、その特定のHOX遺伝子発現によって区別することができる:頭蓋NCCはHOX遺伝子を発現しない、迷走NCCはHOX 1-5を発現し、トランクNCCはHOX 6–9を発現し、仙骨NCCはHOX 10-1112を発現する。その中でも、トランク NCC は symN の主なソースとして認識されます。SymN前駆体は、転写因子MASH1/ASCL113を発現し、これは、PHOX2B14およびINSM115の発現を促進する。15転写因子のGATAファミリーは、後期交感神経発達中に発現される。GATA2 と GATA3 は symN で表現され、DBH16がアクティブになります。転写因子 HAND2 は、DBH および TH17の発現および維持のためにも重要です。
HPSC(例えば、胚性および誘導多能性幹細胞)は、発達パラダイムを再現し、種々のヒト障害の疾患モデリングに使用できるsymNを生成する強力なツール18である。したがって、hPSCからsymNを生成する際には、発達ガイドラインに従い、分化プロセスに沿って適切なマーカーの発現を評価することが重要です。
以前の symN プロトコル
これまでに hPSC19,20,,21から symN の生成を報告した研究グループはほとんどありません。20これらのプロトコルを相互に直接比較し、我々のプロトコルは、最近22を見直した。2016年23年には、symN文字を持つ自律神経細胞の生成のための分化プロトコルを発表しました(図1A)。このプロトコルは、未分化hPSCと細胞分化の両方で使用されたKSRベースの培地を使用しました。さらに、hPSCはマウス胚性線維芽細胞(MEFフィーダー細胞)上に維持された。我々は、障害23をモデル化するためにFD患者からこのプロトコルとPSCを採用しました.2019年には、この古いプロトコル24のより詳細なバージョンを説明しました。要約すると、神経運命は、最初の2日間でTGF-βおよびBMPシグナル伝達を遮断するために二重SMAD阻害25によって誘導された。CHIR99021を用いたWNT活性化は、神経前駆物質をNC細胞に昇格させた。11日目、細胞はCD49D++またはSOX10+集団26、23に対してFACSによってソートされ、23約40%のNC生成効率をもたらした。+したがって、分化の次のステップのための効率と純度を確保するためにソートが必要であった。NccはFGF2とCHIRの併用処理により、スフェロイドとして維持および増幅された。4日後、メンテナンスのNCスフェロイドをメッキし、BDNF、GDNF、およびNGFを与え、symN成熟を終了した。これらのsymNはASCL1、TH、DBH、およびPHOX2Aなどの強力なsymNマーカーを発現したが、ニコチン性アセチルコリン受容体(CHRNA3/CHRNB4)および小胞輸送体(VMAT1/2)の発現を含む、より成熟したsymNのマーカーは、70日後の分化後も低かった。このプロトコルのHOX遺伝子は正式に試験されておらず、細胞の電気生理学的活性を含む成熟した神経特性は検証されなかった。
ここでは、symN を生成するための最適化されたプロトコルを示します (図 1B)。HPSC は、エッセンシャル 8 (E8) メディア27を使用して、ビトロネクチン (VTN) コーティングされた皿のフィーダーフリー条件で維持されます。分化媒体の式は各段階で修正されており、NC母集団28の割合を増加させる。symN成熟はCD49D+/SOX10+ソートまたはソートされていないバルクNCC集団で行うことができます。どちらも30日目までに高レベルのsymNマーカー表現を示す。さらに、このプロトコルで生成されたsymNは、電気生理学的記録およびsymN活性化剤および阻害剤化合物を用いた治療に応答する。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は最近、2つのレビューを発表し、1つは、疾患モデリング31のためのhPSC由来のsymNの使用を議論し、利用可能な分化プロトコル22の詳細な比較を行った。そこで、興味のある研究者がsymNを作ることに成功するために、現在のプロトコルのトラブルシューティングに焦点を当てます。分化プロセス全体の間、一貫したデータと健康な分化細胞を得るために?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ハイジ・ウルリッヒスの原稿の批判的な読み取りと編集に感謝します。
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
References
- Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
- Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity–focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
- Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
- Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
- Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
- Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
- Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
- Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
- Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. 발생학. 244 (2), 329-341 (2002).
- Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).
- Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
- Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
- Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
- Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), 473-481 (2008).
- Trainor, P. . Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).
- Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. 발생학. 277 (2), 271-286 (2005).
- Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
- Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
- Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
- Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
- Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
- Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
- Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
- Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
- Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
- Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
- Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).
