피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건 하에서 인간 다능성 줄기 세포를 사용하여 후갱이온 교감 뉴런의 효율적인 분화
Summary
이 프로토콜에서, 우리는 인간 만능 줄기 세포에서 포스트 갱글리오닉 교감 뉴런의 생성을위한 안정적이고 매우 효율적인 분화 전략을 설명합니다. 이 모델은 여러 자율 장애의 연구의 사용을 위해 뉴런을 사용할 수 있게 합니다.
Abstract
인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)는 시험관 내에서 인간 배아 발달의 질병 모델링 및 연구를위한 강력한 도구가되었습니다. 우리는 이전에 자율 신경 병증을 가진 환자에 적용된 교감 특성을 가진 자율 신경의 파생을 위한 분화 프로토콜을 제시했습니다. 그러나, 프로토콜은 녹아웃 세럼 교체(KSR) 및 피더 기반 배양 조건에 기초하여 구축되었으며, 높은 분화 효율을 보장하기 위해, 세포 선별이 필요하였다. 이러한 요인으로 인해 가변성이 높고 비용이 높으며 재현성이 낮습니다. 또한 전기 활성을 포함한 성숙한 교감 특성은 확인되지 않았습니다. 여기서는 피더가 없고 화학적으로 정의된 배양 조건에서 PSC 배양 및 분화를 수행하는 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 트렁크 신경 문장을 식별하는 유전 마커가 식별됩니다. 세포 선별없이 20 일 후에 후 신경절 교감 뉴런으로의 추가 분화가 달성됩니다. 전기 생리학적 기록은 기능적 뉴런 정체성을 더 나타낸다. 우리의 분화 된 뉴런에서 검출 된 발사니코틴에 의해 강화 될 수 있으며 아드레날린 수용체 길항제 프로프라놀롤에 의해 억제 될 수있다. 이 프로토콜의 중간 교감 신경 전구체는 최대 2주 동안 신경 구형으로서 유지될 수 있으며, 이는 배양을 확장할 수 있게 한다. 요약하면, 우리의 업데이트 된 교감 신경 분화 프로토콜은 이전 버전에 비해 높은 분화 효율, 더 나은 재현성, 더 많은 유연성 및 더 나은 신경 성숙을 보여줍니다. 이 프로토콜은 자율 신경계에 영향을 미치는 인간의 장애를 연구하는 데 필요한 세포를 연구원에게 제공 할 것입니다.
Introduction
포스트 갱글리오닉 교감 뉴런 (symN)은 자율 신경계 (ANS)에 속하며 의식과 무관하게 신체의 항상성을 반응하고 조절하는 데 여러 가지 중요한 역할을합니다. 예를 들어, 스트레스는 심박수를 자극하고 심박수, 혈압 및 발한의 증가로 이어지는 전투 또는 비행 반응을 불러일으킵니다. SymN은 유전학, 독성/상해 또는 다른 질병의 동반자로 인해 여러 인간 장애에 영향을 받습니다. 유전 신경병증의 예로는 심민의 심한 dysregulation이 호흡 곤란을 일으키는 유년기 무질서 가족 성 Dysautonomia (FD)가 있습니다, 땀나기, 피부의 얼룩, 구토 발작, 고혈압 및불안에의해 명백한 dysautonomic 위기. 독성의 예는 화학요법 치료이며, 이는 자율 신경세포에 독성 부작용이 있는 것으로 보고되었다2. 자율적 변성 및 하이퍼-내심성 모두 파킨슨병 또는 고혈압 신장 질환과 같은 질병을 유발하거나 동반할 수 있는 것으로 알려져있다3,4. 따라서, 연구를 수행하고 질병의 맥락에서 symN 생물학 및 결함의 메커니즘을 이해할 수있는 것은 신규하고 효과적인 치료의 검색에 도움이됩니다.
해부학
말초 신경계는 감각 및 자율 분열로 나뉩니다. 감각 신경계의 구심성 신경은 고통과 접촉의 감각에 책임 있는 반면, ANS는 두뇌에 모든 기관에서 정보를 중계하는 책임이 있습니다. ANS는 장신경계로 나뉘어져 있으며, 위장관, 이완에 중요한 부교감 신경계, 장기의 활성화/조절에 중요한 교감신경계(SNS)로 나뉩니다. SNS는 2개의 뉴런시스템을5. 척수에 있는 Preganglionic 교감 신경 축은 교감 신경절에 첫번째 프로젝트, 포스트 ganglionic symN 세포 바디가 있는 곳에. 이 뉴런은 바디에 있는 각 기관의 표적 조직을 안쪽에 긴 투영을 보냅니다. preganglionic 뉴런에 의해 전송 되는 신호는 해, 반면 preganglionic symN은 아드레날린 이며 따라서 표현 노르 (NE) 그들의 주요 신경 전달 물질으로. 혈관을 자극하는 것을 포함하여 해인 포스트 갱글리오닉, 교감 신경의 몇몇 주목할 만한 예외가 있습니다. 아드레날린 성 후 신경 세포는 효소 티로신 하이드록실라제 (TH), 방향족 L 아미노산 데카르박실라제 (AAAD), 도파민 β-하이드록실라제 (DBH), 모노 아민 산화효소 (MAO-A)를 발현하며, 모두 NE를 생성하고 대사하는 역할을합니다. 또한, 그들은 NE 재활용 수송기 및 / 또는 수용체 α-아드레날린 수용체 (ADRA2), β-아드레날린 수용체 (ADR2B), 노르 에피네프린 수송기 (NET1) 및 부식모아민 수송기 (VMAT1/2)를 발현합니다.
개발
배아 발달 시 심멘은 신경관과 오버레이 ectoderm6사이에 나타나는 신경 문장(NC)으로부터 유래되며, 멜라닌세포, 조골세포, 지방세포, 글리아, 장뉴런, 감각 뉴런 및 자율 신경 7을 포함하는 다중 세포 계보로 분화할 수있다. 신경 문장 세포 (NCC)는 배아를 통해서 몇몇 경로를 취하는 높게 철새 세포입니다. NC 개발의 이 초기 단계에서, 세포는 마커 SNAIL1/2, FOXD3 및 SOX108,9,,10,11을표현한다.9, 그들이 채택하는 축 위치와 함께 마이그레이션 경로는 개발할 NC 하위 유형을 결정합니다. 이러한 NC 아류형은 그들의 특이적 HOX 유전자 발현에 의해 구별될 수 있다: 두개골 NCC는 HOX 유전자를 발현하지 않으며, vagal NCC는 HOX 1-5를 발현하고, 트렁크 NCC는 HOX 6-9를 발현하고, 성례 NCC는 HOX 10-1112를발현한다. 그 중, 트렁크 NcC는 symN의 주요 소스로 인식된다. SymN 전구체는 PHOX2B14 및 INSM115의발현을 촉진하는 전사 인자 MASH1/ASCL113을발현한다. 전사 요인의 GATA 가족은 늦은 동정 발달 도중 표현됩니다. GATA2 및 GATA3는 SymN으로 표현되며, 이 시공은 DBH16을활성화합니다. 전사 계수 HAND2는 DBH 및 TH17의발현 및 유지에도 중요하다.
HPSCs(예를 들어, 배아 및 유도 만능 줄기 세포)는 발달 패러다임을 재현하고 다양한 인간 장애의 질병 모델링에 사용될 수 있는 symN을 생성하는 강력한 도구18입니다. 따라서 hPSC에서 symN을 생성하는 동안 개발 지침을 따르고 분화 과정을 따라 적절한 마커의 발현을 평가하는 것이 중요합니다.
이전 symN 프로토콜
몇몇 연구 단은 이전에 hPSCs19,,20,,21에서symN의 생성을 보고했습니다. 이러한 프로토콜을 서로 직접 비교하고 최근22일검토했습니다. 2016년23년,우리는 symN 문자를 가진 자율 뉴런의 생성을 위한 분화프로토콜을 발표했다(도 1A). 이 프로토콜은 미분화 hPSCs 및 세포 분화의 유지보수에 사용된 KSR 기반 배지를 사용하였다. 더욱이, hPSCs는 마우스 배아 섬유아세포(MEF 피더 세포)에서 유지되었다. 우리는 무질서23를모델링하기 위하여 FD를 가진 환자에게서 이 프로토콜 및 PSCs를 이용했습니다. 2019년에는 이 이전 프로토콜24의보다 자세한 버전을 설명했습니다. 요약하면, 신경 운명은 TGF-β 및 BMP 신호화를 처음 2일 동안 차단하기 위해 이중 SMAD억제(25)에 의해 유도되었다. CHIR99021을 이용한 WNT 활성화는 신경 전구를 NC 세포로 승진시켰다. 11일째에, 세포는 CD49D+ 또는+ SOX10+ 인구26,,23에대한 FACS에 의해 분류되었고, 이는 약 40%의 NC 생성 효율을 산출하였다. 따라서, 다음 분화 단계에 대한 효율 및 순도를 보장하기 위해 선별이 필요했다. NFC는 FGF2 및 CHIR의 결합된 처리와 함께 스페로이드로서 유지 및 증폭되었다. 4일 후, NC 스페로이드를 도금하고 BDNF, GDNF 및 NGF를 부여하여 symN 성숙을 완료하였습니다. 이러한 symN은 ASCL1, TH, DBH 및 PHOX2A와 같은 강한 symN 마커를 발현했지만, 니코틴 아세틸콜린 수용체(CHRNA3/CHRNB4) 및 소포 수송기(VMAT1/2)의 발현을 포함하여 보다 성숙한 symn에 대한 마커는 70일 후에도 분화의 일후에도 낮았다. 이 프로토콜에서 HOX 유전자는 공식적으로 시험되지 않았고, 세포의 전기 생리활성을 포함한 성숙한 신경 특성은 확인되지 않았다.
여기서는 symN(그림1B)을생성하기 위해 최적화된 프로토콜을 제시합니다. HPSC는 에센셜 8(E8)미디어(27)를사용하여 비트로넥틴(VTN) 코팅 접시상에서 피더가 없는 조건에서 유지된다. 분화 매체의 공식은 각 단계에서 수정되어 NC인구(28)의비율을 증가시킨다. symN 성숙은 CD49D+/SOX10+ 정렬되거나 정렬되지 않은 대량 NCC 모집단에서 수행할 수 있습니다. 둘 다 30일까지 높은 수준의 symN 마커 식을 보여줍니다. 더욱이, 이 프로토콜로 생성된 symN은 전기 생리학적 기록 및 symN 활성제 및 억제제 화합물을 사용한 치료에 반응한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 최근에 2개의 리뷰를 간행했습니다, 하나는 질병 모델링을 위한 hPSC 파생된 symn의 사용을토론하는 31 뿐만 아니라 유효한 분화 프로토콜22의심층적인 비교. 따라서 여기서는 관심 있는 연구원이 symN을 만드는 데 성공할 수 있도록 현재 프로토콜 문제 해결에 중점을 둡니다. 전체 분화 과정에서 건강한 분화 세포뿐만 아니라 일관된 데이터를 얻기 위해 모?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고의 비판적 독서와 편집에 대한 하이디 울리히스에게 감사드립니다.
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
References
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