Effektiv differentiering av postganglitoniska sympatiska nervceller med hjälp av mänskliga pluripotenta stamceller under Feeder-fria och kemiskt definierade kulturförhållanden
Summary
I detta protokoll beskriver vi en stabil, mycket effektiv differentiering strategi för generering av postganglionic sympatiska nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller. Denna modell kommer att göra nervceller tillgängliga för användning av studier av flera autonoma sjukdomar.
Abstract
Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) har blivit ett kraftfullt verktyg för sjukdomsmodellering och studiet av människans embryonala utveckling in vitro. Vi presenterade tidigare en differentiering protokoll för härledning av autonoma nervceller med sympatisk karaktär som har tillämpats på patienter med autonoma neurotoxiskt. Protokollet byggdes dock på Knock Out Serum Replacement (KSR) och feeder-baserade odlingsförhållanden, och för att säkerställa hög differentieringseffektivitet var cellsortering nödvändig. Dessa faktorer orsakar hög variation, höga kostnader och låg reproducerbarhet. Dessutom har mogna sympatiska egenskaper, inklusive elektrisk aktivitet, inte verifierats. Här presenterar vi ett optimerat protokoll där PSC-kultur och differentiering utförs i matarfria och kemiskt definierade kulturförhållanden. Genetiska markörer identifiera bålen neurala krönet identifieras. Ytterligare differentiering i postganglionic sympatiska nervceller uppnås efter 20 dagar utan behov av cellsortering. Elektrofysiologisk inspelning visar ytterligare den funktionella neuronidentiteten. Bränning upptäcks från våra differentierade nervceller kan förbättras genom nikotin och undertrycks av adrenerga receptorn antagonist propranolol. Mellanliggande sympatiska neurala stamceller i detta protokoll kan upprätthållas som neurala sfäroider i upp till 2 veckor, vilket möjliggör expansion av kulturerna. Sammanfattningsvis visar vår uppdaterade sympatiska neuron differentiering protokoll hög differentiering effektivitet, bättre reproducerbarhet, mer flexibilitet, och bättre neural mognad jämfört med den tidigare versionen. Detta protokoll kommer att ge forskarna de celler som behövs för att studera mänskliga sjukdomar som påverkar det autonoma nervsystemet.
Introduction
Postganglionic sympatiska nervceller (symNs) tillhör det autonoma nervsystemet (ANS) och har flera viktiga roller i att svara och reglera homeostas i kroppen oberoende av medvetande. Till exempel stimulerar stress symNs och framkallar kampen-eller-flykt svar som leder till en ökning av hjärtfrekvens, blodtryck, och svettning. SymNs påverkas i flera mänskliga sjukdomar på grund av genetik, toxicitet / skada, eller som följeslagare till andra sjukdomar. Ett exempel på en genetisk neuropati är barndomssjukdomen Familjär Dysautonomia (FD), där en allvarlig dysregulation av symNs orsakar dysautonomisk kris, uppenbart genom svettning, blotching av huden, kräkningar attacker, hypertoni, och ångest1. Ett exempel på toxicitet är kemoterapi behandling, som har rapporterats ha toxiska biverkningar på autonoma nervceller2. Det är känt att autonoma denervation och hyper-innervation kan både leda till, eller åtfölja, sjukdomar som Parkinsons sjukdom eller hypertensiv njursjukdom3,4. Således är det fördelaktigt att kunna forska och förstå mekanismerna för symN-biologi och defekter i samband med sjukdom för att söka nya och effektiva behandlingar.
Anatomi
Det perifera nervsystemet förgrena sig i sensoriska och autonoma divisioner. De afferent nerverna i det sensoriska nervsystemet är ansvariga för känsla av smärta och beröring, medan ANS är ansvarig för att vidarebefordra information från alla organ till hjärnan. ANS är indelat i det enteriska nervsystemet, innervating av mag-tarmkanalen, det parasympatiska nervsystemet, vilket är viktigt för avkoppling, och det sympatiska nervsystemet (SNS), vilket är viktigt för aktivering/reglering av organ. SNS anpassar ett två-neuron system5. Preganglionic sympatiska neurala axoner i ryggmärgen första projektet till sympatiska ganglier, där postganglionic symN cell organ finns. Dessa nervceller skickar sedan långa projektioner för att innervera målvävnaderna i varje organ i kroppen. Signaler som överförs av preganglionic nervceller är kolinerga, medan postganglionic symNs är adrenerga och därmed uttrycka noradrenalin (NE) som deras huvudsakliga signalsubstans. Det finns några anmärkningsvärda undantag av postganglionic, sympatiska nervceller som är kolinerga, inklusive de innervating blodkärl. Adrenerga postganglionic nervceller uttrycka enzymer tyrosin hydroxylase (TH), aromatiska L-aminosyra decarboxylase (AAAD), dopamin β-hydroxylas (DBH), och monoamin oxidas (MAO-A), alla ansvariga för att generera och metabolisera NE. Dessutom uttrycker de NE återvinning transportörer och/eller receptorer α-adrenerga receptor (ADRA2), β-adrenerga receptor (ADR2B), noradrenalin transportör (NET1), och vesikulär monoamin transportör (VMAT1/2).
Utveckling
Under embryonal utveckling symNs härrör från neurala krönet (NC), som framträder mellan neuralröret och överlagra ectoderm6, och kan skilja i flera cell härstamningar, inklusive melanocyter, osteoblaster, adipocyter, glia, enteriska nervceller, sensoriska nervceller, och autonoma nervceller7. Neurala crest celler (NCCs) är långvandrande celler som tar flera vägar genom embryot. I detta tidiga skede av NC utveckling, cellerna uttrycka markörer SNAIL1/2, FOXD3, och SOX108,9,10,11. Migreringsvägen tillsammans med den axiella plats som de antar bestämmer den NC-undertyp som de kommer att utvecklas till. Dessa NC subtyper kan särskiljas genom deras specifika HOX genuttryck: Cranial NCCs inte uttrycka HOX gener, vagal NCCs express HOX 1-5, trunk NCCs express HOX 6-9, och sakrala NCCs express HOX 10-1112. Bland dem är trunk NCCs erkända som den viktigaste källan till symNs. SymN prekursorer uttrycka transkriptionsfaktorn MASH1/ASCL113, som främjar uttryck för PHOX2B14 och INSM115. Gata familjen av transkriptionsfaktorer uttrycks under sen sympatisk utveckling. GATA2 och GATA3 uttrycks i symNs, som i sin tur aktiverar DBH16. Transkriptionsfaktorn HAND2 är också viktig för uttryck och underhåll av DBH och TH17.
HPS (t.ex. embryonala och inducerade pluripotenta stamceller) är ett kraftfullt verktyg18 för att rekapitalitulera utvecklingsparadigm och generera symN som sedan kan användas för sjukdomsmodellering av olika mänskliga sjukdomar. Samtidigt som symNs skapas från hPSC är det därför viktigt att följa utvecklingsriktlinjerna och bedöma uttryck för lämpliga markörer längs differentieringen.
Tidigare symN-protokoll
Få forskargrupper har tidigare rapporterat generering av symNs från hPSCs19,20,21. Den direkta jämförelsen av dessa protokoll till varandra och vår granskades nyligen22. I 201623, Vi publicerade en differentiering protokoll för generering av autonoma nervceller med symN karaktär (Figur 1A). Detta protokoll används KSR-baserade medium, som användes i både underhåll av odifferentierade hPSCs och cell differentiering. Dessutom bibehölls hPSCs på mus embryonala fibroblaster (MEF feeder celler). Vi använde detta protokoll och PSCs från patienter med FD att modellera sjukdomen23. Under 2019 beskrev vi en mer detaljerad version av detta äldre protokoll24. Sammanfattningsvis var neurala ödet framkallas av dubbla SMAD hämning25 att blockera TGF-β och BMP signalering under de första 2 dagarna. WNT aktivering med CHIR99021 främjas neurala förfäder att bli NC celler. På dag 11, celler sorterades av FACS för CD49D+ eller SOX10+ populationer26,23, som gav cirka 40% NC generation effektivitet. Det behövdes därför sortering för att säkerställa effektiviteten och renhetsgraden för nästa steg i differentiering. NCCs bibehölls och förstärktes som sfäroider med kombinerad behandling av FGF2 och CHIR. Efter 4 dagar var NC sfäroider av underhåll pläterade och ges BDNF, GDNF och NGF att avsluta symN mognad. Även om dessa symNs uttryckt starka symN markörer såsom ASCL1, TH, DBH och PHOX2A, markörer för mer mogna symNs, inklusive uttryck för nikotinacetylkolin receptorn (CHRNA3/CHRNB4) och vesicle transportör (VMAT1/2), var låga även efter 70 dagars differentiering. HOX gener i detta protokoll testades inte formellt, och mogna neurala egenskaper, inklusive elektrofysiologisk aktivitet av cellerna, kontrollerades inte.
Här presenterar vi ett optimerat protokoll för att generera symNs(Figur 1B). HPSCs underhålls i matarfria förhållanden, på vitronectin (VTN)-belagda rätter, med Essential 8 (E8) media27. Formeln för differentieringsmedierna har ändrats i varje steg, vilket ökar andelen av NC-befolkningen28. Den symN mognad kan göras på CD49D+/SOX10+ sorterade eller osorterade bulk NCC populationer. Båda visar höga nivåer av symN markör uttryck av dag 30. Dessutom är de symN som genereras med detta protokoll lyhörda för elektrofysiologisk inspelning och behandlingar med symN aktivator och hämmare föreningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi publicerade nyligen två recensioner, en diskuterar användningen av hPSC-härledda symNs för sjukdom modellering31 samt en djupgående jämförelse av tillgängliga differentiering protokoll22. Således fokuserar vi här på felsökning av det nuvarande protokollet för att hjälpa den intresserade forskaren att lyckas göra symNs. Under hela differentieringsprocessen, för att få konsekventa data samt friska differentierade celler, bör kontaminering i alla steg kont…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Heidi Ulrichs för kritisk läsning och redigering av manuskriptet.
Materials
| 100 mm cell culture dishes | Falcon | 353003 | |
| 15 mL conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-664 | |
| 24-well tissue culture plates | Falcon | 353047 | |
| 24-well ultra-low-attachment plates | Corning | 07 200 601 and 07 200 602 | |
| 5% CO2/20% O2 tissue culture incubator | Thermo Fisher/Life Technologies | Heracell VIOS 160i | |
| 50 ml conical tissue culture tubes | VWR/Corning | 89039-656 | |
| 6-well tissue culture plates | Costar | 3516 | |
| Accutase | Innovation Cell Technologies | AT104500 | Cell dissociation solution |
| Anti-AP2a antibody | Abcam | ab108311 | Host: Rabbit; 1:400 dilution |
| Anti-Ascl1 antibody | BD Pharmingen | 556604 | Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution |
| Anti-CD49D antibody | BioLegend | 304313 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-CD49D antibody (isotype) | BioLegend | 400125 | Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume |
| Anti-DAPI antibody | Sigma | D9542 | 1:1000 dilution |
| Anti-DBH antibody | Immunostar | 22806 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab13970 | Host: Chicken; 1:1000 dilution |
| Anti-HOXC9 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-365692 | Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution |
| Anti-NET1 antibody | Mab | NET17-1 | Host: Mouse; 1:1000 dilution |
| Anti-PRPH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-377093/H0112 | Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution |
| Anti-SOX10 antibody | Abcam | ab50839 | Host: Mouse; 1:100 dilution |
| Anti-TH antibody | Pel-Freez | P40101- 150 | Host: Rabbit; 1:500 dilution |
| Ascorbic acid | Sigma | A8960-5G | Stock concentration: 100 mM |
| B27 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 12587-010 | Stock concentration: 50x |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | Stock concentration: 10 μg/mL |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Stock concentration: 6 mM |
| Cell counter | Thermo Fisher/Life Technologies | Countess II | |
| Cell counting chamber slides | Invitrogen | C10312 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 57021&5424R | |
| CHIR99021 | R&D Systems | 4423 | Stock concentration: 6 mM |
| Cryo-vial | Thermo Fisher/Life Technologies | 375353 | |
| dbcAMP | Sigma | D0627 | Stock concentration: 100 mM |
| DMEM | Thermo Fisher/Life Technologies | 10829-018 | Stock concentration: 1x |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher/Life Technologies | 11330-057 | Stock concentration: 1x |
| DMSO | Thermo Fisher/Life Technologies | BP231-100 | |
| E6 medium | gibco | A15165-01 | |
| E8 medium | gibco | A15169-01 | Stock concentration: 1x |
| E8 supplement | gibco | A15171-01 | Stock concentration: 50x |
| EDTA | Sigma | ED2SS | Stock concentration: 0.5 M |
| Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) | Axion BioSystems | M768-tMEA-96W | |
| FACS machine | Beckman Coulter | CytoFLEX (for FACS) | |
| FACS machine | Beckman Coulter | MoFlo Astrios EQ (for sorting) | |
| FACS tubes (blue filter cap) | Falcon | 352235 | |
| FACS tubes (white cap) | Falcon | 352063 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| GDNF | PeproTech | 450 | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x |
| hPSCs | Thomson et al., (1998) | WA09 | |
| hPSCs | Oh et al. (2016) | H9-PHOX2B::eGFP | |
| Human fibronectin (FN) | VWR/Corning | 47743-654 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| L-glutamine | Thermo Fisher/Gibco | 25030-081 | Stock concentration: 200 mM |
| LN tank | Custom Biogenic Systems | V-1500AB | |
| MEA reader | Axion BioSystems | Maestro Pro | |
| Mouse laminin I (LM) | R&D Systems | 3400-010-01 | Stock concentration: 1 mg/mL |
| N2 supplement | Thermo Fisher/Life Technologies | 17502-048 | Stock concentration: 100x |
| Neurobasal medium | gibco | 21103-049 | Stock concentration: 1x |
| NGF | PeproTech | 450-01 | Stock concentration: 25 μg/mL |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 14190-136 | Stock concentration: 1x |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) | Sigma | P3655 | Stock concentration: 15 mg/mL |
| Primocin (antibiotics) | InvivoGen | ANTPM1 | Stock concentration: 50 mg/mL |
| qPCR machine | Bio-Rad Laboratories | C1000 Touch | |
| qPCR plates | Bio-Rad Laboratories | HSP9601 | |
| recombinant FGF2 | R&D Systems | 233-FB/CF | Stock concentration: 10 μg/mL |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Stock concentration: 1 mM |
| SB431542 | Tocris/R&D Systems | 1614 | Stock concentration: 10 mM |
| Trypan blue | Corning | MT-25-900-CI | |
| Vitronectin (VTN) | Thermo Fisher/Life Technologies | A14700 | Stock concentration: 0.5 mg/mL |
| Water bath | VWR/Corning | 706308 | |
| Y27632 | R&D Systems | 1254 | Stock concentration: 10 mM |
References
- Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
- Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity–focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
- Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
- Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
- Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
- Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. . The Neural Crest. , (1999).
- Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
- Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
- Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. 발생학. 244 (2), 329-341 (2002).
- Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), 4220-4231 (2012).
- Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
- Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
- Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
- Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), 473-481 (2008).
- Trainor, P. . Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , (2013).
- Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. 발생학. 277 (2), 271-286 (2005).
- Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
- Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
- Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
- Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
- Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
- Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
- Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
- Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
- Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
- Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
- Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).
