프로토콜은 방광, 전립선, 성기관, 뼈, 근육 및 발 피부를 포함한 마우스 하반신의 시상 수혈에 대해 설명된다.
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방법 논문
마우스에서 하복부 장기 및 뒷다리의 시투 폐쇄 회로 관류 에 설립
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Ex 생체 내 관류는 고립 된 장기 (예 : 간, 신장)의 기능을 연구하는 중요한 생리적 도구입니다. 동시에, 마우스 장기의 작은 크기로 인해 뼈, 방광, 피부, 전립선 및 생식 기관의 전 생체 풍부는 도전적이거나 불가능합니다. 여기서, 우리는 상기 조직을 포함하는 마우스에 있는 시투 하체 관류 회로에서 처음으로 보고합니다, 그러나 주요 정리 기관 (신장, 간 및 비장)를 우회합니다. 회로는 상복부 대동맥과 정맥 위에 복부 대동맥과 열등한 베나 카바를 캔터링하고 말초 혈관을 소작함으로써 확립된다. 관류는 최대 2시간 동안 유지되는 난투류 흐름을 가진 연동 펌프를 통해 수행됩니다. 형광 렉틴 과 Hoechst 용액으로 시투 염색에서 마이크로 혈관이 성공적으로 침투된 것을 확인했습니다. 이 마우스 모형은 병리학적인 프로세스뿐만 아니라 약물 전달의 기계장치, 종양에서 종양 세포를 순환하는 이동/전이, 그리고 관전된 기관 및 조직과의 면역 계통의 상호 작용을 연구하기 위한 아주 유용한 공구일 수 있습니다.
서론
고립 된 기관 관류는 원래 이식에대한 장기 생리학을 연구하기 위해 개발되었다1,2,,3,다른 신체 시스템에서 간섭없이 장기의 기능에 대한 이해를 가능하게. 예를 들어, 고립 된 신장과 심장 관류는 혈역학의 기본 원리와 혈관 활성제의 효과를 이해하는 데 대단히 유용했지만, 간 관류는 건강하고 병은 조직4,,5,,6,,7에서약물 대사를 포함한 대사 기능을 이해하는 데 중요했다. 또한, 관류 연구는 이식을 위한 장기의 생존력과 기능을 이해하는 데 중요했습니다. 암 연구에서, 고립 된 종양 관류는 마우스, 쥐 및 갓 절제 된 인간 조직을 사용하여 여러 그룹에 의해 설명되었다8,,9. 일부 고립된 종양 관류에서, 종양은 난소 지방 패드에 이식되어 간질동맥(10)으로부터
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프로토콜
여기에 설명 된 모든 방법은 콜로라도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 관류 시스템을 예열
- 도 1A의맞춤형 구성에 도시된 바와 같이 모든 수자 성분(난투저수지, 습한 챔버 및 뚜껑)에 대해 37°C 순환 수조를 시작하여 수술 전에 관류 시스템을 준비한다. 튜브가 깨끗하고 필요한 경우 교체하십시오. 난투 부피를 제한하려면, 난투 저수지로 습한 챔버 내에서 버블 트랩을 사용(도 1B-6).
2. 혈관 카테터라이제이시
- 이소플루란 수의 마취기를 사용하여 8-10주 된 BALB/c 마우스에서 마취를 유도하여 3-5%의 이소플루란 및 산소 유량0.3 L/min에서 방출을 유도한다. 대안으로, 케타민 /자일라진 또는 다른 유형의 관음증을 사용하십시오. 발가락 핀치와 각막 반사 : 2 가지 방법으로 마취의 깊이를 평가합니다.
- 4-0 실크 봉합사를 바늘로 두 번 증류한 물에 미리 웨트합니다.
- 마취 된 마우스를 스티로폼 보드에 척추 위치에 놓고 머리....
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결과
우리는 10mL 미만의 관류 완충제의 양을 유지하면서 8-10 주 된 마우스의 복부 대자와 열등한 정맥 카바의 캔레이션을 통해 폐쇄 회로 관류 시스템을 설정합니다. 그림 3A는 Hoechst 33342 및 DyLight 649-lectin을 포함하는 링거의 솔루션으로 조직을 인응한 후 공초점 이미지를 보여줍니다. 근육, 골수, 고환, 방광, 전립선 및 발 피부는 효율적인 핵 및 혈관 염색을 보여줍니다. 도 3B는 3시간의 규범 관류 후 장기의 헤마톡시린-에오신 염색을 나타낸다.
그림 1. 단순화된 관류 설정. (A)
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토론
설명된 회로는 각종 연구 질문, 예를 들어 약물 전달에 있는 상이한 혈청 성분 및 조직 장벽의 역할, 또는 면역 및 줄기 세포 밀매를 탐구하기 위하여 이용될 수 있다. 상이한 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜 및 나노입자)은 전달에서 생리학적 및 생화학적 인자의 역할을 이해하기 위해 서두자에 첨가될 수 있다. 관류의 지속 기간은 연구 된 조직, 과학적 목표 및 perfusate의 구성에 따라 다를 수 있습니다. 우리는 여기에 젖산과 알부민링의 용액으로 구성된 기본 관류 매체를 사용하여 2 h까지 관류의 결과를 제시합니다. 본 작업의 목적은 최적의 기관/조직 기능 및 산소화를 지원하기 위해 관류 배지 및 조건을 개발하고 최적화하는 대신 관류 회로를 확립하는 것이었다는 점에 유의해야 한다. 영양소, 비타민, 호르몬 및 혈액세포의 첨가는 이전 문헌에서 광범위하게 조사되었으며, 수많은 관류 미디어 및 산소화 프로토콜은 인간 및 동물조직에서수십 건의 연구 간행물에서 기술되어7,
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
연구 결과는 DS, 약학 ADR 종자 교부금 프로그램의 Skaggs 학교에 NIH 교부금 CA194058에 의해 지원되었습니다 (DS); 중국 국립자연과학재단(교부금 제31771093), 지린성 국제협력프로젝트(20180414085GH), 중앙대학의 기초연구기금, JLU 과학기술혁신연구팀 프로그램(2017TD-27, 2019TD-36).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| 3.5x-90x 스테레오 줌 현미경 붐 스탠드에 LED 조명 | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| 이산화탄소, USP | Airgas 헬스케어 | 19087-5283 | |
| 컨포칼 현미경 | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| 일회용 멸균 소추 펜, 고온 | FIAB | 포함F7244 | |
| 습한 챔버 버블 트랩 (그림 1의 6 부) | Harvard Apparatus | 733692 | perfisate 용기로 사용자 정의; 또한 일정한 압력 관류 가능 |
| 석영 창이있는 습한 챔버 커버 (그림 1의 3 부) | 챔버의 온도를 유지 | 733524하기위한 | Harvard Apparatus |
| 금속 튜브 열교환 기가있는 습한 챔버 | Harvard Apparatus | 732901 | 관류액과 마우스 온도를 유지하기 위한 뚜껑이 있는 워터 재킷 습식 챔버 |
| 봉합사 절단기가 있는 Olsen-Hegar 바늘 홀더 | FST(Fine Science Tools) | 125014 | |
| 산소 압축, USP | Airgas 헬스케어 | C2649150AE06 | |
| 롤러 펌프(그림 4의 파트 1) | Harvard Apparatus | 730113 | 습한 챔버 |
| 의 캐뉼라에 관류액을 전달합니다.SCP plugsys 서보 제어 F/관류(그림 1의 파트 1) | Purfusion 속도를 제어하는 | Harvard | 732806 |
| 실리콘 패드 | Harvard Apparatus | ||
| 실리콘 튜빙 세트(그림 1의 화살표) | Harvard Apparatus(TYGON) | 733456 | |
| 학생 표준 패턴 집게 | Fine Science Tools(FST) | 91100-12 | |
| 수술용 가위 | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| 습윤 챔버용 표 | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator(그림 1의 파트 2) | Harvard Apparatus | 724927 | 모든 워터 재킷 구성 요소에 대한 순환 수조 |
| 3방향 마개(그림 1의 5부) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| 수의학 마취기 | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide 바늘 | BD | 305186 | Insyte Autoguard 날개 바늘을 고정시키고 피질 뼈를 긁는 데 사용됩니다 |
| 4-0 실크 봉합 | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 실크 봉합 | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| 필터 ( 0.2 & 마이크로; m) | ThermoFisher | 42225-CA | 필터 5% BSA-RINGER' S |
| 영구 마커 | Staedtler | 342-9 | |
| 주사기 (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| 주사기 (60 mL) | 5 | % BSA-RINGER용 BD 309653 필터 S | |
| 시약 | |||
| 1% 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.5)에 Evans 블루(w/v) 시 | 그마 | 314-13-6 | |
| 10% 완충 포르말린 | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c 마우스(8-10주령) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| 소 혈청 알부민 | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| 시아노아크릴레이트 접착제 | 크레이지 접착제 | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories, Inc. | ZB1214 | |
| 에탄올 (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| 인산염 완충 식염수 | Gibco | 10010023 |
참고문헌
- Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125(2019).
- Kabagambe, S. K., et al.
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재인쇄 및 허가
