Een protocol wordt beschreven voor in situ perfusie van het onderlichaam van de muis, met inbegrip van de blaas, de prostaat, geslachtsorganen, bot, spier en voethuid.
Ex vivo perfusie is een belangrijk fysiologisch hulpmiddel om de functie van geïsoleerde organen (bijvoorbeeld lever, nieren) te bestuderen. Tegelijkertijd is een uitdaging of niet haalbaar vanwege de kleine omvang van de muisorganen, ex vivo perfusie van bot, blaas, huid, prostaat en voortplantingsorganen. Hier rapporteren we voor het eerst een in situ lager lichaam perfusie circuit in muizen die de bovenstaande weefsels omvat, maar omzeilt de belangrijkste klaring organen (nier, lever, en milt). Het circuit wordt vastgesteld door het afzwmen van de abdominale aorta en inferieure vena cava boven de iliacale slagader en ader en cauterizing perifere bloedvaten. Perfusie wordt uitgevoerd via een peristaltische pomp met perfusate flow gehandhaafd voor maximaal 2 uur. In situ kleuring met fluorescerende lectine en Hoechst oplossing bevestigd dat de microvasculatuur met succes werd geperfuseerd. Dit muismodel kan een zeer nuttig hulpmiddel zijn voor het bestuderen van pathologische processen en mechanismen voor de levering van geneesmiddelen, migratie/metastase van circulerende tumorcellen in/van de tumor en interacties van het immuunsysteem met geperfundeerde organen en weefsels.
Geïsoleerde orgaanperfusie werd oorspronkelijk ontwikkeld om orgaanfysiologie te bestuderen voor transplantatie1,2,3, en maakte het mogelijk om het inzicht in functies van de organen te begrijpen zonder interferentie van andere lichaamssystemen. Geïsoleerde nier- en hartperfusie was bijvoorbeeld enorm nuttig bij het begrijpen van basisprincipes van hemodynamica en effecten van vasoactieve agentia, terwijl leverperfusie belangrijk was voor het begrijpen van de metabole functie, inclusief medicijnmetabolisme in gezond en ziek weefsel4,5,6,7. Bovendien waren perfusiestudies van cruciaal belang voor het begrijpen van de levensvatbaarheid en functie van organen die bestemd waren voor transplantatie. In Cancer Researchearch, geïsoleerde tumor perfusie is beschreven door verschillende groepen met behulp van muis, rat, en vers gereseceerde menselijke weefsels8,9. In sommige geïsoleerde tumorperfusie werd de tumor geïmplanteerd in het eierstokvetkussen om de groei van de tumor die bloedvaten levert van de mesenterieslagader10te forceren. De Jain-groep voerde baanbrekende studies uit met behulp van geïsoleerde perfusie van colonadenocarcinomen om tumorhemodynamica en metastase8,11,12,13te begrijpen . Andere innovatieve engineered ex vivo setups omvatten een 96-well plate-based perfusie apparaat om de primaire menselijke multiple myeloom cellen14 en een modulaire flow kamer voor engineering beenmerg architectuur en functie onderzoek15cultuur.
Naast fysiologie en pathologiestudies is orgaanperfusie gebruikt om de basisprincipes van de levering van geneesmiddelen te bestuderen. Zo beschreef een groep geïsoleerde rattenledemaatperfusie en bestudeerde hij de ophoping van liposomen in geïmplanteerde sarcoman16, terwijl een andere groep ontleede menselijke nierperfusie uitvoerde om de endotheel targeting van nanodeeltjes17te bestuderen. Ternullo et al. gebruikte een geïsoleerde geperfuseerde menselijke huidflap als een ingebouwde vivo huidmedicijn penetratiemodel18.
Ondanks deze vooruitgang in perfusie van grote organen en weefsels, zijn er geen rapporten over in situ perfusiemodellen in muizen die: a) klaringsorganen zoals lever, milt en nieren omzeilen; b) bekkenorganen, huid, spieren, voortplantingsorganen (bij mannen), blaas, prostaat en beenmerg omvatten. Vanwege de geringe omvang van deze organen en de leverende vasculatuur is ex vivo cannulation en de totstandbrenging van een perfusiecircuit niet haalbaar geweest. De muis is het belangrijkste diermodel in kanker en immunologie onderzoek, en de levering van geneesmiddelen. De mogelijkheid om kleine muisorganen te doornemen zou het mogelijk maken interessante vragen met betrekking tot de levering van geneesmiddelen aan deze organen, waaronder tumoren geïmplanteerd in het bekken (blaas, prostaat, eierstok, beenmerg), worden beantwoord, evenals studies van de fundamentele fysiologie en immunologie van ziekten van deze organen. Om dit tekort aan te pakken, ontwikkelden we een in situ perfusiecircuit bij muizen dat mogelijk weefselletsel kan voorkomen en veel beter geschikt is voor functioneel onderzoek dan geïsoleerde orgaanperfusie.
Het beschreven circuit kan worden gebruikt om verschillende onderzoeksvragen te onderzoeken, bijvoorbeeld de rol van verschillende serumcomponenten en weefselbarrières bij de levering van geneesmiddelen, of immuun- en stamcelhandel. Verschillende systemen voor de levering van geneesmiddelen (bijvoorbeeld liposomen en nanodeeltjes) kunnen aan het perfusaat worden toegevoegd om de rol van fysiologische en biochemische factoren bij de levering te begrijpen. De duur van de perfusie kan variëren, afhankelijk van het onderzo…
The authors have nothing to disclose.
De studie werd ondersteund door de NIH subsidie CA194058 aan DS, Skaggs School of Pharmacy ADR seed grant program (DS); National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31771093), het Project of International Collaboration of Jilin Province (No.201180414085GH), de Fundamental Research Funds for the Central Universities, het Program for JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).
Equipment | |||
3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
Materials | |||
19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
Reagents | |||
1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |