Création in situ de la perfusion en circuit fermé des organes abdominaux inférieurs et des membres postérieurs chez les souris
Summary
Un protocole est décrit pour la perfusion in situ du bas du corps de la souris, y compris la vessie, la prostate, les organes sexuels, les os, les muscles et la peau du pied.
Abstract
La perfusion ex vivo est un outil physiologique important pour étudier la fonction des organes isolés (p. ex. foie, reins). Dans le même temps, en raison de la petite taille des organes de souris, la perfusion ex vivo des organes d’os, de vessie, de peau, de prostate, et de reproduction est difficile ou non faisable. Ici, nous rapportons pour la première fois un circuit in situ de perfusion inférieure du corps chez les souris qui inclut les tissus ci-dessus, mais contourne les organes principaux de dégagement (rein, foie, et rate). Le circuit est établi en canniler l’aorte abdominale et le vena cava inférieur au-dessus de l’artère et de la veine iliaques et en cautérisant les vaisseaux sanguins périphériques. La perfusion est effectuée par l’intermédiaire d’une pompe péristaltique avec débit perfusate maintenu jusqu’à 2 h. La coloration in situ avec la lectine fluorescente et la solution de Hoechst a confirmé que la microvasculature a été perfusée avec succès. Ce modèle de souris peut être un outil très utile pour étudier les processus pathologiques ainsi que les mécanismes de l’administration de médicaments, la migration / métastases des cellules tumorales circulantes dans / de la tumeur, et les interactions du système immunitaire avec des organes et des tissus perfusés.
Introduction
La perfusion d’organe isolé a été développée à l’origine pour étudier la physiologie d’organe pour la transplantation1,2,3, et a permis la compréhension des fonctions des organes sans interférence d’autres systèmes de corps. Par exemple, la perfusion rénale et cardiaque isolée était extrêmement utile pour comprendre les principes de base de l’hémodynamique et les effets des agents vasoactifs, tandis que la perfusion hépatique était importante pour comprendre la fonction métabolique, y compris le métabolisme des médicaments dans les tissus sains et malades4,5,6,7. En outre, les études de perfusion étaient critiques dans la compréhension de la viabilité et de la fonction des organes destinés à la transplantation. Dans cancer Researchearch, perfusion tumorale isolée a été décrite par plusieurs groupes utilisant la souris, le rat, et les tissus humains fraîchement réséqués8,9. Dans une perfusion de tumeur isolée, la tumeur a été implantée dans le tampon de graisse d’ovaire pour forcer la croissance de la tumeur fournissant des vaisseaux sanguins de l’artère mésentery10. Le groupe Jain a effectué des études pionnières utilisant la perfusion isolée des adénocarcinomes du côlon pour comprendre l’hémodynamique tumorale et la métastase8,11,12,13. D’autres configurations ex vivo innovantes comprennent un dispositif de perfusion à base de plaques de 96 puits pour la culture des cellules primaires du myélome multiple humain14 et une chambre modulaire de flux pour l’architecture de la moelle osseuse d’ingénierie et la recherche de fonction15.
En plus des études de physiologie et de pathologie, la perfusion d’organes a été utilisée pour étudier les principes de base de l’administration de médicaments. Ainsi, un groupe a décrit la perfusion isolée de membre de rat et a étudié l’accumulation des liposomes dans les sarcomes implantés16, tandis qu’un autre groupe a exécuté la perfusion de rein humain disséquée pour étudier le ciblage endothélial des nanoparticules17. Ternello et coll. ont utilisé un rabat de peau humain perfusé isolé comme modèle de pénétration de drogue de peau proche-à-in vivo18.
Malgré ces progrès dans la perfusion de grands organes et tissus, il n’y a eu aucun rapport sur les modèles in situ de perfusion chez les souris qui : a) contournent les organes de dégagement tels que le foie, la rate et les reins ; b) comprennent les organes pelviens, la peau, les muscles, les organes reproducteurs (chez les hommes), la vessie, la prostate et la moelle osseuse. En raison de la petite taille de ces organes et de la vascularisation de fourniture, la cannulation ex vivo et l’établissement d’un circuit de perfusion n’a pas été possible. La souris est le modèle animal le plus important dans la recherche sur le cancer et l’immunologie, et la livraison de médicaments. La capacité de perfuse de petits organes de souris permettrait de répondre à des questions intéressantes concernant l’administration de médicaments à ces organes, y compris aux tumeurs implantées dans le bassin (vessie, prostate, ovaire, moelle osseuse), ainsi qu’à des études de physiologie et d’immunologie de base des maladies de ces organes. Pour remédier à cette carence, nous avons développé un circuit de perfusion in situ chez les souris qui peuvent potentiellement éviter les lésions tissulaires et qui est beaucoup mieux adapté à la recherche fonctionnelle que la perfusion d’organes isolé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le circuit décrit peut être utilisé pour sonder diverses questions de recherche, par exemple le rôle de différents composants sériques et barrières tissulaires dans l’administration de médicaments, ou le trafic de cellules immunitaires et souches. Différents systèmes d’administration de médicaments (p. ex., liposomes et nanoparticules) peuvent être ajoutés au perfusate afin de comprendre le rôle des facteurs physiologiques et biochimiques dans l’administration. La durée de la perfusion peut varier, s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude a été appuyée par la subvention ca194058 des NIH à DS, Skaggs School of Pharmacy ADR ased grant program (DS); National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31771093), le Project of International Collaboration of Jilin Province (No.201180414085GH), the Funds Funds for the Central Universities, the Program for JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).
Materials
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
References
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