Markerless Gene Deletion di Mamicino Scambio Allelicas in Chlamydia trachomatis
Summary
Descritto qui è un metodo per la delezione genica mirata e senza marcatori nella chlamydia trachomatis utilizzando la mutagenesi di scambio letale delle cassette scambiate, FLAEM.
Abstract
La chlamydia trachomatis è un patogeno intracellulare obbligatorio che è stato storicamente difficile da manipolare geneticamente. Il progresso definitivo nel chiarire i meccanismi che C. trachomatis utilizza per creare e mantenere una nicchia intracellulare privilegiata è stato limitato a causa della mancanza di strumenti genetici. Fortunatamente, di recente ci sono stati diversi nuovi progressi nelle tecniche di manipolazione genetica. Tra questi vi è lo sviluppo della mutagenesi dello scambio allelico segnalato dalla fluorescenza (FRAEM). Questo metodo consente la delezione mirata del gene accoppiato con l’inserimento di una cassetta di selezione codifica resistenza agli antibiotici e proteina fluorescente verde (GFP). La dipendenza da questa strategia può essere complicata quando si prendono di mira i geni all’interno di operoni polcistronici a causa del potenziale di effetti polari sui geni a valle. La mutagenesi allelica dello scambio di cassette flosche (FLAEM), il cui protocollo è descritto qui, è stato sviluppato per alleviare gli effetti polari indotti da cassette. FLAEM utilizza l’editing del genoma Cre-loxP per rimuovere la cassetta di selezione dopo la cancellazione mirata per scambio allelico. I ceppi risultanti contengono delezioni geniche senza marcatori di una o più sequenze di codifica. Questa tecnica facilita la valutazione diretta della funzione genica ed espande il repertorio di strumenti per la manipolazione genetica in C. tracommata.
Introduction
La clamidia transamata è la principale causa di malattie batteriche sessualmente trasmissibili e rappresenta un onere significativo per la salute umana. Oltre 100 milioni di persone sono infettate ogni anno da C. trachomatis1. Circa il 70% delle infezioni nelle donne sono asintomatiche nonostante gli effetti dannosi sulla salute riproduttiva, come la malattia infiammatoria pelvica, la gravidanza ectopica e/o l’infertilità. Il sequela della malattia è direttamente correlato all’immunopatologia iniziata da C. infezione da tracommatide 2. Un vaccino efficace deve ancora essere sviluppato; pertanto, comprendere la funzione dei fattori di virulenza batterica e di altri prodotti genici batterici è una questione di ricerca importante e urgente.
Come batteri intracellulari, l’invasione delle cellule ospiti, la replicazione intracellulare, il rilascio di progenie e l’evasione delle risposte immunologiche ospiti sono processi critici. C. tracommatide forma una membrana parassofosa legata vacuole, chiamato inclusione, per lo sviluppo intracellulare. L’istituzione dell’inclusione e di molti altri processi critici si ottiene mediante la secrezione di proteine efsiate tramite un sistema di secrezione di tipo III (T3SS)3. Chiarire le funzioni di questi efficaci secreti è stato limitato per molti anni a causa dell’intrattabilità genetica di C. tracomatis. A differenza di E. coli, molte tecniche di clonazione classiche non sono applicabili alla clamidia. Alcune limitazioni principali riguardano l’efficienza della trasformazione, la mancanza di controselezione dei reporter come sacB e la manutenzione del plasmide. Mentre i plasmidi E. coli possono generalmente essere mantenuti a tempo indeterminato con un’origine di replicazione e di adeguata pressione selettiva, C. trachomatis plasmis richiede altri otto frame di lettura aperti (pgp1-8) per la manutenzione che si trovano sul plasmide nativo di pL2 all’interno del sierovarL2 4.
Negli ultimi anni sono stati generati diversi strumenti genetici che ospitano la biologia unica della clamidia, eppure ci sono ancora limitazioni5,6,7. La mutagenesi chimica mediante trattamento con metanoesolino etilico (EMS) può introdurre mutazioni di fracivi o (meno frequentemente) può provocare transizioni nucleotidiche che introducono un codone di arresto prematuro per produrre una mutazione senza senso8. L’inserimento di trasposoni è efficiente per la disgregazione genica, ma la tecnologia attuale nella ricerca della clamidia è laboriosa e richiede moltotempo. Sia il trattamento EMS che le tecniche di mutagenesi trasposoni generano mutazioni casuali e richiedono rigorosi metodi di screening per isolare i ceppi mutanti. Un metodo per interrompere i geni mediante l’inserimento di introni di gruppo II (ad esempio, TargeTron) consente la mutagenesi diretta; tuttavia, questo metodo è limitato dall’efficienza e il sito di inserimento non è sempre previsto correttamente10.
La mutagenesi di scambio allelico segnalata dalla fluorescenza (FRAEM) è una strategia utilizzata per la cancellazione genica mirata accoppiata con l’inserimento di una cassetta di selezione che fornisce resistenza agli antibiotici e un reporter a fluorescenza11. Tuttavia, il FRAEM è complicato dal potenziale degli effetti polari indotti da cassette sui geni a valle, specialmente quando si prendono di mira i geni all’interno degli operoni polcistronici. La mutagenesi allelica allocante a cassette flosche (FLAEM) è un nuovo approccio genetico sviluppato per alleviare gli effetti polari indotti dalla cassetta precedentemente osservati con la cassetta di selezione FRAEM12. FLAEM utilizza l’editing del genoma Cre-loxP per rimuovere la cassetta di selezione e ripristinare l’espressione dei geni a valle. La cassetta di selezione contenente resistenza agli antibiotici e proteina fluorescente verde (GFP) è riprogettata con siti loxP di fianco. Questi siti loxP possono ricombinarsi in presenza di Cre ricombinase e provocare l’escissione della cassetta dal genoma13. Questa strategia ha dimostrato di alleviare gli effetti polari indotti in cassetta quando si mira tmeA perl’eliminazione 12,14.
Entrambi i metodi FRAEM e FLAEM utilizzano lo stesso vettore di suicidio, pSUmC 4.0, che può essere mantenuto in modo condizionale attraverso l’espressione inducibile di pgp6. L’espressione di pgp6 è stata precedentemente dimostrata necessaria per la ritenzione plasmide ed è quindi sfruttata per controllare la manutenzione del plasmide11,15. Quando C. trachomatis viene coltivato in media integrati con tetraciclina anidisca (aTc) per indurre l’espressione pgp6, il vettore viene mantenuto. In assenza di aTc, il vettore viene perso. La cancellazione mirata del gene si ottiene attraverso lo scambio allelico del gene per la cassetta di selezione. Le regioni da 3 kb direttamente a monte e a valle del gene bersaglio fungono da bracci di omologia per la ricombinazione. Questi bracci sono clonati nel vettore pSUmC 4.0 che fiancheggia la cassetta di selezione. Gli eventi di trasformazione e ricombinazione C. trachomatis di successo sono osservati attraverso la segnalazione della fluorescenza. L’espressione di mCherry sulla spina dorsale vettoriale e gfp all’interno della cassetta di selezione produce inclusioni fluorescenti rosse e verdi. Una volta che l’aTc viene rimosso dai mezzi di coltura, le inclusioni solo verdi indicano eventi di ricombinazione riusciti con la perdita del vettore suicida e l’integrazione della cassetta di selezione nel genoma batterico.
FLAEM rappresenta un’estensione del FRAEM attraverso la successiva trasformazione di un vettore che esprime Cre ricombinase, pSU-Cre, nel ceppo mutante appena creato. Cre ricombinase facilita la ricombinazione tra i siti loxP e l’escissione della cassetta di selezione. Gli eventi di ricombinazione sono indicati tramite segnalazione di fluorescenza. Il vettore pSU-Cre codifica mCherry; pertanto, la trasformazione riuscita è indicata dall’aggiunta di fluorescenza rossa alle inclusioni che esprimono gfp. La coltivazione in assenza di pressione selettiva per la cassetta comporta una ricombinazione mediata in Cre nei siti loxP, e la perdita della cassetta è indicata da inclusioni solo rosse. Come per pSUmC-4.0, l’espressione inducibile di pgp6 viene utilizzata per mantenere in modo condizionale pSU-Cre. Una volta rimossa la selezione aTc e antibiotica, il plasmide viene curato e il conseguente ceppo di delezione senza marcatore non è fluorescente. Questo metodo affronta la questione degli effetti polari indotti da cassette.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui per la generazione di delezioni di geni markerless in C. trachomatis da FLAEM consente la delezione mirata di geni non essenziali ed elimina gli effetti polari indotti da cassette. Il protocollo si basa su un’attenta progettazione di bracci di omologia 5′ e 3′ inseriti nel vettore suicida pSUmC 4.0, da una trasformazione efficiente della tracomatide DiC e da un attento screening di ceppi mutanti isolati. Il successo dell’ingegneria genomica tramite questo metodo produce batte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Servizio Sanitario Pubblico del National Institute of Health, NIAID (concede A1065530 e Al124649), a K.A. Fields.
Materials
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam–/dcm– Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
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