高分解能X線吸収分光法を用いた極低温でのスペシエーションのための生体試料調製

Summary

このプロトコルは、シンクロトロンベースのX線吸収分光法実験のために生物学的クライオサンプルを調製するための詳細な手順を提示する。サンプル調製と凍結保存を最適化するために必要なすべてのステップを、がん細胞と植物プランクトン細胞を用いたプロトコルの例で説明します。この方法は、サンプルクライオ調製の普遍的な標準を提供します。

Abstract

X線吸収分光法(XAS)による元素の研究は、生物学的システムにおける金属の役割を研究する際に特に興味深い。サンプル調製は、特に生物学的サンプルにとって、重要でしばしば複雑な手順です。X線スペシエーション技術は広く使用されているが、詳細なプロトコルはまだこの技術のユーザに普及していない。さらに、化学状態の改変が懸念されており、細胞または組織の化学的完全性の最大の保存を提供するために、生物学的サンプルをほぼ天然の水和状態で分析するために、クライオベースの技術が推奨されます。ここでは、凍結保存試料に基づく細胞調製プロトコールを提案する。これは、癌細胞におけるセレンの高エネルギー分解能蛍光検出X線吸収分光法研究および植物プランクトン中の鉄の研究において実証されている。このプロトコルは、他の生物学的サンプルおよび照射によって損傷を受ける可能性のある他のX線技術と共に使用することができる。

Introduction

必須または毒性元素の細胞内変換の研究には、高感度のスペシエーション技術が必要であり、化学種の改変を受けやすいことが多いサンプル調製ステップを最小限に抑える必要があります。

セレンや鉄などの生理学的元素は、その複雑な化学的性質、セレンまたは鉄種の様々な安定性、およびppm(mg / kg)またはサブppm範囲でのそれらの低濃度のために、種分化することが特に困難であることが知られている。したがって、XASによるこれらの元素のスペシエーションの研究は、非常に困難な場合があります。シンクロトロンXAS、特に高エネルギー分解能蛍光検出XAS(HERFD-XAS)は、非常に低いシグナル対バックグラウンド比¹を可能にし、シンクロトロン源で利用可能な、複雑な生物学的マトリックス^2,3中の高度に希釈された元素をスペシエーションする。従来の蛍光XAS測定は、欧州放射光施設(ESRF)⁴のCRG-FAMEビームライン上で、エネルギー帯域幅約150~250eVのエネルギー分解固体検出器(SSD)を使用して実行できますが、HERFD-XAS測定には、ESRF2のCRG-FAME-UHDビームライン上で、約1~3eVのエネルギー帯域幅を持つ水晶分析器分光器(CAS)が必要です。.蛍光光子は、それぞれ電子的または光学的プロセスによってそれらのエネルギーに関して区別される。

サンプルクライオ調製は、構造を維持し、組成化学的完全性を維持するために不可欠であり、したがって、生物学的天然状態⁵に近い分析を可能にする。さらに、液体ヘリウム極低温冷却(LN₂)を使用して10 Kという低い極低温で実施された分析により、放射線損傷が減速し、XASの元素スペシエーションが維持されます。生物学的試料に適用されたXAS技術に関するいくつかのレビューは、極低温条件下で試料を調製および分析する必要性を報告しているが(例えば、Sarretら⁶、Porcaro et ^al.7)、それらのどれも関連する詳細なプロトコルを明確に記述していない。この公報では、極低温での^Se8 および^Fe9 のHERFD−XASスペシエーションについて、癌細胞およびプランクトン微生物の凍結調製方法が記載されている。

最先端のXAS分光法測定中のサンプル調製と環境のための良い習慣は、1)セットアップを必要とします。2)放射線障害の影響を可能な限り制限する分析手順。3)試料(またはモデル化合物参照)をX線光子ビームサイズに対してできるだけ均質にする。第1の項目は、液体ヘリウムクライオスタットを用いて低温で取得を行うことによって考慮される。第2の項目は、梁に対してそれを移動させることによってサンプルの新鮮な領域に対して各取得を行うことによって対処される。最後に、第3の条件を考慮すると、サンプル(ペレット)および参照(粉末)は、気孔率および不均一性を可能な限り制限し、X線プローブされたサンプル表面上のビームサイズに対する粗さを避けるために、プレスバルクペレットにコンディショニングされる。プロトコルがこれらすべての点をどのように処理するかを説明します。

ヒト前立腺細胞株PC-3(転移能が高い)と卵巣細胞株OVCAR-3(卵巣がん症例全体の最大70%を占める)を用いて、セレンナノ粒子(Se-NP)のがん細胞に対する抗増殖特性を調べ、モデル種として Phaeodactylum tricornutum Diatom をモデル種として、植物プランクトン中の鉄隔離を調べました。

Protocol

セレンスペシエーションのためのヒトPC-3およびOVCAR-3癌細胞ペレットの調製 注:以下のプロトコルは、Weekleyら10から適合されている。すべてのステップは、無菌技術を使用して、バイオセーフティレベル2の条件および制限の下で細胞培養フードの下で実施されなければならない。 マラセス細胞計数室を用いて細胞を計数する。PC-3細胞株について?…

Representative Results

これらの調製物の主な目的は、セレンナノ粒子(Se-NP)と癌細胞との間の相互作用、ならびに植物プランクトンにおける鉄結合および隔離を調査することであった。 初期状態(BSA Se-NPs)および栄養培地中でインキュベートした細胞(24時間インキュベーション後のBSA Se-NPs)におけるセレンのHERFD-XANESスペクトルを図10に示す。その結果、初期のSe-NP中のセレ?…

Discussion

このプロトコルは、X線吸収分光法によって生物学的サンプル中のセレンおよび鉄の化学的形態を研究するために使用された。これは、生物学的サンプルおよび参照化合物のクライオ調製および保管、ならびにHERFD-XAS測定に焦点を当てています。

クライオ調製および貯蔵
バルク生物学的試料ペレットの凍結調製は、試料中に存在する種の化学的完全性の保?…

Materials

Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C