مراقبة تجميع eIF4F من خلال قياس تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية من شأنه أن يمكن المستخدم من تقييم الاضطراب الناجم عن المخدرات للديناميكيات المعقدة eIF4F في أشكال الفحص.
Abstract
وقد تبين أن تشكيل مجمع eIF4F هو العقدة الرئيسية في المصب للتقارب بين مسارات الإشارات التي غالبا ما تخضع للتنشيط على نحو غير مركب في البشر. eIF4F هو مجمع ربط الحد الأقصى المشاركة في مرحلة التوظيف مرنا-ريبوسوم من بدء الترجمة. في العديد من النماذج الخلوية وما قبل السريرية للسرطانات ، يؤدي إلغاء تحرير eIF4F إلى زيادة ترجمة مجموعات فرعية محددة من الحمض النووي الريبي تشارك في انتشار السرطان والبقاء على قيد الحياة. eIF4F هو مجمع ثلاثي التريك مبني من وحدة ربط الغطاء الفرعية eIF4E ، وeIF4A helicase والوحدات الفرعية للسقالات eIF4G. حاسمة لتجميع مجمعات eIF4F النشطة هو التفاعل البروتين البروتين بين eIF4E والبروتينات eIF4G. في هذه المقالة، نقوم بوصف بروتوكول لقياس تجميع eIF4F الذي يراقب حالة تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية. كما يسمح اختبار التفاعل بين البروتين البروتيني القائم على الخلايا eIF4e:4G بتقييم التغيرات الناجمة عن المخدرات في سلامة eIF4F المعقدة بدقة وموثوقية. ونحن نتصور أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها للتحقق من نشاط المركبات المتاحة تجاريا أو لمزيد من الفحص للمركبات أو الطرائق الجديدة التي تعطل بكفاءة تشكيل مجمع eIF4F.
Introduction
تلعب السيطرة على التعبير الجيني دورا محوريا في التنفيذ الصحيح للبرامج الخلوية مثل انتشار النمو والتمايز. يمكن أن تمارس آلية الرقابة التنظيمية إما على مستوى النسخ الجيني أو على مستوى ترجمة الحمض النووي الريبي. في العقد الماضي ، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن التحكم التحويلي عن طريق تعديل عملية البدء بدلا من الخطوات اللاحقة للاستطالة والإنهاء يمكن أن ينظم بدقة تركيب مجموعات فرعية محددة من البروتينات التي تلعب مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية.
وقد تورطت زيادة ترجمة mRNAs المشاركة في البقاء على قيد الحياة، والاستجابات المضادة ل autophagic ومكافحة المبرمج في العديد من أنواع السرطان وارتبطت أيضا بشكل سببي إما تنشيط منحرفة أو أكثر من التعبير عن عوامل بدء الترجمة1.
مجمع eIF4F هو المنظم الرئيسي لبدء الترجمة. من خلال ربط هيكل الحد الأقصى على نهاية 5 ‘من mRNAs، eIF4F يقود التوظيف الأولي مرنا-ريبوسوم وبالتالي زيادة كفاءة الترجمة مرنا من mRNAs eukaryotic ترجمة ضعيفة2. تم الإبلاغ عن ترجمة eIF4F بوساطة من mRNAs المرتبطة بالسرطان للعديد من نماذج السرطان التي تؤوي التنشيط الشاذ لمسارات RAS /MAPK أو AKT / TOR ، مما يشير إلى أن الخلايا السرطانية ترفع eIF4F لتعزيز نشاطها المؤيد للأورام. تعطيل هذه الحلقة تغذية إلى الأمام عن طريق تثبيط تشكيل eIF4F المعقدة وبالتالي استراتيجية علاجية واعدة جدا3،4.
يتكون مجمع eIF4F من (i) eIF4E ، الوحدة الفرعية الملزمة للغطاء eIF4F التي تتفاعل مع هيكل الغطاء الموجود في UTR 5 من mRNA ، (ii) eIF4A ، وحقيبة طائرات RNA و (3) eIF4G ، بروتين السقالة الذي يتفاعل مع كل من eIF4A و eIF4E والذي يجند في نهاية المطاف 40S ribosomal subunit5. ارتباط eIF4G مع eIF4E هو خطوة الحد من معدل لتجميع المجمعات eIF4F وظيفية وينظم سلبا من قبل eIF4E ملزمة البروتينات (4EBPs، أعضاء 1 و 2 و 3))6. من خلال التنافس مع ربط eIF4G إلى eIF4E من خلال واجهة تتكون من تسلسلات ربط eIF4E الكنسية وغير الكنسية7و8و9 (منطقة تمتد aa 604-646 على eIF4E البشري) ، يقلل 4EBP من مجموعة eIF4E المشاركة بنشاط في الترجمة ومنع تشكيل eIF4F المعقد. يتم تنظيم التفاعل بين هذه التفاعلات البروتين البروتين أساسا من قبل هدف الثدييات من راباميسين (mTOR) بوساطة الفوسفور من 4EBP. على المحفزات mitogenic، mTOR الفوسفور مباشرة أعضاء الأسرة البروتين 4E-BP، وخفض ارتباطهم مع eIF4E، وبالتالي، وتعزيز التفاعل eIF4E-eIF4G وتشكيل مجمعات eIF4F وظيفية10.
على الرغم من الجهد الكبير في تطوير المركبات التي تستهدف سلامة eIF4F المعقدة ، فإن عدم وجود مقايسات تقيس التعطيل المباشر لتفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية قد حد من البحث عن مركبات ضرب نشطة خلوية. لقد طبقنا فحص لوسيفيراز على أساس تناظري coelenterazine (على سبيل المثال، فحص التكامل القائم على Nanoluc) لمراقبة حالة سلامة eIF4F في الوقت الحقيقي من خلال تفاعل eIF4E-eIF4G. يتكون نظام بروتين مكمل لوسيفيراز من جزء بروتين 18 kDa (SubA) و 11 جزء ببتيد من الأحماض الأمينية (SubB) تم تحسينه لتحقيق الحد الأدنى من الارتباط الذاتي والاستقرار11. مرة واحدة أعرب عن منتج الانصهار مع eIF4E طول الإنسان الكامل والمجال التفاعل eIF4E من eiF4G1 الإنسان (aa 604-646)، واثنين من البروتينات التفاعل سوف تجلب SubA وS subB جزء في القرب من بعضها البعض، وسوف تحفز على تشكيل لوسيفيراز النشطة التي، في وجود خلية نفاذية الركيزة، وسوف تولد في نهاية المطاف إشارة مضيئة(الشكل 1). لقد أبلغنا في مكان آخر عن بناء وإقرار eIF4E:eIF4G604-646 نظام استكمال16.
هنا، نقوم بوصف كيف يمكن تطبيق نظام إكمال eIF4E:eIF4G604-646 (متوفر عند الطلب) لقياس اضطراب eIF4E-eIF4G بوساطة 4EBP1 بدقة في الخلايا الحية. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نثبت فائدتها من خلال قياس آثار العديد من مثبطات mTOR التي تخضع حاليا للتجارب السريرية والأدوية العلاجية المحتملة للسرطان12. ولأن الآثار خارج الهدف غالبا ما تخفي نشاطا خاصا بالعقاقير، فإننا نصف أيضا كيف يمكن توسيع نطاق تعدد استخدامات قياس نظام eIF4E:eIF4G604-646 مع القياسات المتعامدة للقدرة على البقاء الخلوية لأخذ هذه القياسات في الاعتبار.
Protocol
Representative Results
Discussion
تستخدم الطريقة الموضحة في هذه المقالة م المقايسة التكميلية المستندة إلى لوسيفيراز لرصد التجميع المعقد eIF4F كميا من خلال القياس المباشر لتفاعل eIF4G-eIF4E في الخلايا الحية. لقد قدمنا تفاصيل لاستخدام نظام إكمال eIF4E-eIF4G وأظهرنا أيضا أن النظام دقيق للغاية في قياس التفكك بوساطة 4EBP1 الناجم عن المخدرا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من الميزانية الأساسية من P53lab (BMSI ، A * STAR) ومنحة JCO VIP (A * STAR).
Materials
| 293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| Cell culture microplate 96 well, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
| Cell titer Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
| Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | not applcable | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
| FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
| Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| Orbital shaker | Eppendorf | not appicable | |
| γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose | Jena Bioscience | AC-155S |
References
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
- Bhat, M., et al. Targeting the translation machinery in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).
- Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development. 암 연구학. 75 (2), 250-263 (2015).
- Montanaro, L., Pandolfi, P. P. Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E. Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).
- Merrick, W. C. eIF4E: A retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
- Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G. Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).
- Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).
- Grüner, S., et al. The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation. Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).
- Gingras, A. C., et al. Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1. Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Sun, S. Y. mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs. Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Sekiyama, N., et al. Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).
- Muller, D., et al. 4E-BP restrains eIF4E phosphorylation. Translation. 1 (2), e25819 (2013).
- Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly. BMC Biology. (1), 40 (2019).
- Ran, X., Gestwicki, J. E. Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area. Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).
