Мониторинг сборки eIF4F путем измерения взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках
Summary
Здесь мы представляем протокол для измерения взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках, который позволил бы пользователю оценить индуцированные наркотиками возмущения сложной динамики eIF4F в форматах скрининга.
Abstract
Было показано, что формирование комплекса eIF4F является ключевым нисходящим узелом для конвергенции сигнальных путей, которые часто подвергаются онкогенной активации у людей. eIF4F является комплексом, связывающим крышку, участвующим в этапе набора мРНА-рибосомы для начала перевода. Во многих клеточных и доклинических моделей рака дерегулирование eIF4F приводит к увеличению перевода конкретных подмножего мРНК, которые участвуют в распространении и выживании рака. eIF4F – это гетеро-тримерный комплекс, построенный из подразделительного подразделения eIF4E, вертолетного шкафа eIF4A и строительного подразделения eIF4G. Критически важным для сборки активных комплексов eIF4F является белково-белковое взаимодействие между белками eIF4E и eIF4G. В этой статье мы описываем протокол для измерения сборки eIF4F, который отслеживает состояние взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках. Анализ взаимодействия белково-белковой системы eIF4e:4G также позволяет точно и надежно оценивать вызванные препаратом изменения в комплексной целостности eIF4F. Мы предполагаем, что этот метод может быть применен для проверки деятельности коммерчески доступных соединений или для дальнейшего скрининга новых соединений или методов, которые эффективно нарушают образование комплекса eIF4F.
Introduction
Контроль экспрессии генов играет ключевую роль в правильном исполнении клеточных программ, таких как пролиферацию роста и дифференциацию. Механизм регулятивного контроля может осуществляться либо на уровне транскрипции генов, либо на уровне перевода мРНК. В последнее десятилетие становится все более очевидным, что трансляционный контроль путем модуляции процесса инициации, а не более поздних шагов удлинение и прекращение может тонко регулировать синтез конкретных подмножего белков, которые играют широкий спектр биологических функций.
Увеличение перевода мРНК, участвующих в выживании, антиавтофагических и анти-апоптотических ответов были вовлечены в несколько видов рака, а также были причинно связаны либо с аномальной активации или за выражение факторов инициацииперевода 1.
Комплекс eIF4F является мастер-регулятором инициирования перевода. Связывая кап-структуру на 5′ конце мРНК, eIF4F является движущей силой первоначального набора мРНА-рибосомы и, в свою очередь, повышает эффективность перевода мРНК слабо переведенных эукариотическихмРНК 2. eIF4F опосредованное перевод связанных с раком mRNAs было сообщено для многих моделей рака укрывательство аномальной активации RAS / MAPK или АКТ / ТОР пути, предполагая, что раковые клетки upregulate eIF4F для повышения их собственной про-неопластической активности. Нарушение этой кормовой петли путем ингибирования комплексного формирования eIF4F является, таким образом, очень перспективной терапевтическойстратегией 3,4.
Комплекс eIF4F состоит из (i) eIF4E, кап-связывающего подразделения eIF4F, которое взаимодействует со структурой крышки, найденной в 5′ UTR mRNA, (ii) eIF4A, RNA helicase и (iii) eIF4G, белок эшафота, который взаимодействует как с eIF4A, так и с eIF4E и который в конечном итоге набирает 40S рибосомныйсубъедин. eIF4G ассоциация с eIF4E является ограничивающим скорость шагом для сборки функциональных комплексов eIF4F и негативно регулируется связывающими белками eIF4E (4EBPs, члены 1, 2 и 3))6. Конкурируя с eIF4G, связывающим eIF4E через интерфейс, который состоит из канонических и неканонических eIF4Eсвязывающих последовательностей 7,8,9 (регион, охватывающий aa 604-646 на человеческом eIF4E), 4EBP уменьшает пул eIF4E, активно участвующих в переводе и предотвращении комплексного формирования eIF4F. Взаимодействие этих белково-белковых взаимодействий в основном регулируется целью млекопитающих рапамицина (mTOR)-опосредованного фосфорилирования 4EBP. При митогенных стимулах mTOR непосредственно фосфорилатирует членов семьи белков 4E-BP, уменьшая их связь с eIF4E и тем самым способствуя взаимодействию eIF4E-eIF4G и формированию функциональных комплексов eIF4F10.
Несмотря на большие усилия по разработке соединений, ориентированных на сложную целостность eIF4F, отсутствие анализов, измеряя прямое нарушение взаимодействия eIF4E-eIF4G в живых клетках, ограничило поиск клеточных активных пораженных соединений. Мы применили анализ люциферазы на основе аналога коэнтеразина (например, анализ дополнений на основе Nanoluc) для мониторинга в режиме реального времени состояния целостности eIF4F через взаимодействие eIF4E-eIF4G. Белковая система дополнения люциферазы состоит из фрагмента белка 18 кДа (SubA) и 11 аминокислот пептидного фрагмента (SubB), оптимизированного для минимальной самоа ассоциациии стабильности 11. После того, как выражается как продукт синтеза с человеческой полной длины eIF4E и eIF4E взаимодействия домена от человека eiF4G1 (аа 604-646), два взаимодействующих белков принесет SubA и SubB фрагмент в непосредственной близости друг от друга и будет вызывать образование активной люциферазы, что, в присутствии ячейки проницаемый субстрат, в конечном итоге генерировать яркий люминесцентный сигнал (Рисунок 1). Мы сообщали в других местах о строительстве и проверке системы дополнения eIF4E:eIF4G604-646 16.
Здесь мы описываем, как система дополнения eIF4E:eIF4G604-646 (доступна по запросу) может быть применена для точного измерения нарушения работы 4EBP1 при посредничестве eIF4E-eIF4G в живых клетках. Кроме того, мы демонстрируем его полезность, измеряя эффекты нескольких ингибиторов mTOR, которые в настоящее время находятся под клиническими испытаниями в качестве потенциальных терапевтическихпрепаратов рака 12. Поскольку внецелеспособные эффекты часто маскируют деятельность, связанную с наркотиками, мы также описываем, как универсальность измерения системы eIF4E:eIF4G604-646 может быть расширена с помощью ортогональных измерений клеточной жизнеспособности с учетом этих данных.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный в этой статье, использует анализ дополнения на основе люциферазы для количественного мониторинга комплексной сборки eIF4F путем прямого измерения взаимодействия eIF4G-eIF4E в живых клетках. Мы предоставили подробную информацию для использования системы дополнения eIF4E-eIF4G, и …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана основным бюджетом от p53lab (BMSI, АЗХАРД) и ГРАНТА JCO VIP (АЗСТА).
Materials
| 293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| Cell culture microplate 96 well, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
| Cell titer Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
| Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | not applcable | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
| FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
| Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| Orbital shaker | Eppendorf | not appicable | |
| γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose | Jena Bioscience | AC-155S |
References
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
- Bhat, M., et al. Targeting the translation machinery in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).
- Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development. 암 연구학. 75 (2), 250-263 (2015).
- Montanaro, L., Pandolfi, P. P. Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E. Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).
- Merrick, W. C. eIF4E: A retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
- Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G. Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).
- Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).
- Grüner, S., et al. The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation. Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).
- Gingras, A. C., et al. Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1. Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Sun, S. Y. mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs. Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Sekiyama, N., et al. Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).
- Muller, D., et al. 4E-BP restrains eIF4E phosphorylation. Translation. 1 (2), e25819 (2013).
- Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly. BMC Biology. (1), 40 (2019).
- Ran, X., Gestwicki, J. E. Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area. Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).
