Umålrettet flydende kromatografi-massespektrometri-baserede metabolomiske analyse af hvedekorn
Summary
En metode til ikke-målrettet analyse af hvede korn metabolitter og lipider præsenteres. Protokollen indeholder en acetonitril metabolit ekstraktionsmetode og omvendt fase flydende kromatografi-masse spektrometri metode, med erhvervelse i positive og negative elektrospray ionisering tilstande.
Abstract
En forståelse af samspillet mellem gener, miljø og forvaltning i landbrugspraksis kunne give mulighed for en mere nøjagtig forudsigelse og forvaltning af produktudbytte og -kvalitet. Metabolomics data giver en udlæsning af disse interaktioner på et givet tidspunkt og er informativ af en organismes biokemiske status. Endvidere kan individuelle metabolitter eller paneler af metabolitter anvendes som præcise biomarkører for udbytte og kvalitetsforudsigelse og -styring. Planten metabolom forventes at indeholde tusindvis af små molekyler med varierede fysisk-kemiske egenskaber, der giver mulighed for en biokemisk indsigt i fysiologiske træk og biomarkør opdagelse. For at udnytte dette, et centralt mål for metabolomics forskere er at fange så meget af den fysisk-kemiske mangfoldighed som muligt inden for en enkelt analyse. Her præsenterer vi en flydende kromatografi-masse spektrometri-baserede umålrettede metabolomics metode til analyse af markdyrket hvedekorn. Metoden bruger den flydende kromatograf kvomernære opløsningsmiddel manager til at indføre en tredje mobil fase og kombinerer en traditionel omvendt fase gradient med en lipid-modtagelig gradient. Kornforberedelse, metabolitekstraktion, instrumental analyse og databehandlingsarbejdsgange er beskrevet i detaljer. God massenøjagtighed og signalreproducerbarhed blev observeret, og metoden gav ca. 500 biologisk relevante funktioner pr. ioniseringstilstand. Endvidere blev der fastlagt betydeligt forskellige metabolit- og lipidfunktionssignaler mellem hvedesorter.
Introduction
En forståelse af samspillet mellem gener, miljø og forvaltningspraksis i landbruget kunne give mulighed for en mere nøjagtig forudsigelse og forvaltning af produktudbytte og -kvalitet. Plantemetabolitter påvirkes af faktorer som genom, miljø (klima, nedbør osv.) og i et landbrugsmiljø, hvordan afgrøder forvaltes (dvs. anvendelse af gødning, fungitid osv.). I modsætning til genomet påvirkes metabolomet af alle disse faktorer, og derfor giver metabolomiske data et biokemisk fingeraftryk af disse interaktioner på et bestemt tidspunkt. Der er normalt et af to mål for en metabolom-baseret undersøgelse: for det første at opnå en dybere forståelse af organismens biokemi og hjælpe med at forklare mekanismen for reaktion på forstyrrelser (abiotisk eller biotisk stress) i forhold til fysiologi; og for det andet at knytte biomarkører til den undersøgte forstyrrelser. I begge tilfælde er resultatet af at have denne viden en mere præcis ledelsesstrategi for at nå målet om forbedret udbyttestørrelse og kvalitet.
Planten metabolom forventes at indeholde tusindvis1 af små molekyler med varierede fysisk-kemiske egenskaber. I øjeblikket kan ingen metabolomiske platforme (overvejende massespektrometri og nuklear magnetisk resonansspektroskopi) fange hele metabolomet i en enkelt analyse. Udvikling af sådanne teknikker (prøve forberedelse, metabolit ekstraktion og analyse), som giver så stor en dækning af metabolom som muligt inden for en enkelt analytisk køre, er et centralt mål for metabolomics forskere. Tidligere ikke-målrettede metabolomanalyser af hvedekorn har kombineret data fra flere kromatografiske separationer og erhvervelsepolariteter og/eller instrumentering for større metabolomdækning. Dette har imidlertid krævet, at prøver blev fremstillet og erhvervet separat for hver modalitet. F.eks. udarbejdede Beleggia et al.2 en afledte prøve til GC-MS-analysen af polaranalysatorer ud over GC-MS-analysen af de ikke-polære analysatorer. Das et al.3 anvendte både GC- og LC-MS-metoder til at forbedre dækningen i deres analyser. Denne fremgangsmåde vil dog generelt kræve særskilte prøvepræparater som beskrevet ovenfor samt to uafhængige analytiske platforme. Tidligere analyser af hvedekorn ved hjælp af GC-MS3,5 2,,3,,4 og LC-MS 3 , 5 platforme har givet 50 til 412 (55 identificerede) funktioner til GC-MS, 409 for kombineret GC-MS og LC-MS og flere tusinde for en LC-MS lipidomics analyse5. Ved at kombinere mindst to tilstande i en enkelt analyse, udvidet metabolom dækning kan opretholdes, øge den rigdom af biologisk etolkning og samtidig tilbyde besparelser i både tid og omkostninger.
For at muliggøre en effektiv adskillelse af en bred vifte af lipidarter ved omvendt fase kromatografi, moderne lipidomics metoder almindeligt bruger en høj andel af isopropanol i eluering opløsningsmiddel6, giver forbedring til lipid klasser, der ellers ville være uløste ved kromatografi. For en effektiv lipidseparation er startmobilfasen også meget højere i organisk sammensætning7 end de typiske omvendte fasekromatografiske metoder, der tager hensyn til andre klasser af molekyler. Den høje organiske sammensætning i starten af gradienten gør disse metoder mindre egnede til mange andre klasser af molekyler. Mest bemærkelsesværdigt, omvendt fase flydende kromatografi beskæftiger en binær opløsningsmiddel gradient, begyndende med en for det meste vandig sammensætning og stigende i organisk indhold som eluering styrken af kromatografi øges. Til dette formål forsøgte vi at kombinere de to tilgange for at opnå adskillelse af både lipid og ikke-lipid klasser af metabolitter inden for en enkelt analyse.
Her præsenterer vi en kromotografisk metode, der bruger en tredje mobil fase og muliggør en kombineret traditionel omvendt fase og lipidomics-passende kromatografimetode ved hjælp af en enkelt prøveforberedelse og en analytisk kolonne. Vi har vedtaget mange af de kvalitetskontrolforanstaltninger og datafiltreringstrin, der tidligere er blevet implementeret i overvejende kliniske metabolomundersøgelser. Disse tilgange er nyttige til bestemmelse af robuste egenskaber med høj teknisk reproducerbarhed og biologisk relevans og udelukker dem, der ikke opfylder disse kriterier. For eksempel beskriver vi gentagen analyse af den samlede QC prøve8, QC korrektion9, data filtrering9,10 og imputation af manglende funktioner11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenterer vi en LC-MS-baseret ikke-målrettet metabolomics metode til analyse af hvedekorn. Metoden kombinerer fire anskaffelsestilstande (omvendt fase og lipid-modtagelig omvendt fase med positiv og negativ ionisering) i to tilstande ved at indføre en tredje mobil fase i den omvendte fasegradient. Den kombinerede metode gav ca. 500 biologisk relevante træk pr. ionpolaritet, idet ca. halvdelen af disse var væsentligt forskellige i intensitet mellem hvedesorter. Væsentlige ændringer i metabolitkoncentrationen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende West Australian Premier’s Landbrug og Fødevarer Fellowship program (Department of Jobs, Turisme, Videnskab og Innovation, regeringen i Western Australia) og Premier’s Fellow, professor Simon Cook (Center for digitalt landbrug, Curtin Universitet og Murdoch Universitet). Feltforsøg og kornprøve indsamling blev støttet af regeringen i Western Australia’s Royalties for Regioner program. Vi anerkender Grantley Stainer og Robert French for deres bidrag til feltforsøg. Den NCRIS-finansierede Bioplatforms Australien er anerkendt for finansiering af udstyr.
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
