Summary

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Published: March 13, 2020
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Summary

Eine Methode zur ungezielten Analyse von Weizenkornmetaboliten und Lipiden wird vorgestellt. Das Protokoll umfasst eine Acetonit-Metabolit-Extraktionsmethode und eine umgekehrte Phase-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Methodik mit Erfassung in positiven und negativen Elektrospray-Ionisationsmodi.

Abstract

Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Genen, der Umwelt und dem Management in der landwirtschaftlichen Praxis könnte eine genauere Vorhersage und Verwaltung von Produktertrag und -qualität ermöglichen. Metabolomics-Daten liefern ein Auslesen dieser Wechselwirkungen zu einem bestimmten Zeitpunkt und sind informativ über den biochemischen Status eines Organismus. Darüber hinaus können einzelne Metaboliten oder Metaboliten-Panels als präzise Biomarker für ertrags- und Qualitätsvorhersage und -management verwendet werden. Das pflanzliche Metabolom wird voraussichtlich Tausende von kleinen Molekülen mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften enthalten, die eine Chance für einen biochemischen Einblick in physiologische Eigenschaften und Biomarker-Entdeckung bieten. Um dies zu nutzen, besteht ein zentrales Ziel für Die Forscher der Metabolomik darin, so viel wie möglich von der physikalisch-chemischen Vielfalt in einer einzigen Analyse zu erfassen. Hier stellen wir eine flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie-basierte ungezielte Metabolomik-Methode zur Analyse von Feldweizenkorn vor. Das Verfahren nutzt den quaternären Lösungsmittelmanager des Flüssigchromatographen, um eine dritte mobile Phase einzuführen und kombiniert einen traditionellen umgedrehten Phasengradienten mit einem lipidfreundlichen Gradienten. Getreideaufbereitung, Metabolitenextraktion, instrumentelle Analyse und Datenverarbeitungs-Workflows werden ausführlich beschrieben. Es wurden eine gute Massengenauigkeit und Signalreproduzierbarkeit beobachtet, und die Methode ergab etwa 500 biologisch relevante Merkmale pro Ionisationsmodus. Darüber hinaus wurden signifikant unterschiedliche Metaboliten- und Lipid-Feature-Signale zwischen Weizensorten bestimmt.

Introduction

Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Genen, Umwelt und Managementpraktiken in der Landwirtschaft könnte eine genauere Vorhersage und Verwaltung von Produktertrag und -qualität ermöglichen. Pflanzenmetaboliten werden durch Faktoren wie Genom, Umwelt (Klima, Niederschlag usw.) und in einer landwirtschaftlichen Umgebung beeinflusst, wie Pflanzen bewirtschaftet werden (d. h. Die Anwendung von Düngemitteln, Fungizid usw.). Im Gegensatz zum Genom wird das Metabolom durch all diese Faktoren beeinflusst und daher liefern Metabolomik-Daten einen biochemischen Fingerabdruck dieser Wechselwirkungen zu einem bestimmten Zeitpunkt. Es gibt in der Regel eines von zwei Zielen für eine Metabolomik-basierte Studie: erstens, um ein tieferes Verständnis der Biochemie des Organismus zu erreichen und helfen, den Mechanismus der Reaktion auf Störungen (abiotischen oder biotischen Stress) in Bezug auf die Physiologie zu erklären; und zweitens, Biomarker mit der untersuchten Störung in Verbindung zu bringen. In beiden Fällen ist das Ergebnis dieses Wissens eine präzisere Managementstrategie, um das Ziel einer verbesserten Ertragsgröße und -qualität zu erreichen.

Das Pflanzenmetabolom wird voraussichtlich Tausende von1 kleinen Molekülen mit verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften enthalten. Derzeit können keine Metabolomik-Plattformen (vorwiegend Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie) das gesamte Metabolom in einer einzigen Analyse erfassen. Die Entwicklung solcher Techniken (Probenvorbereitung, Metabolitenextraktion und -analyse), die eine möglichst große Abdeckung des Metaboloms innerhalb eines einzigen analytischen Laufs bieten, ist ein zentrales Ziel für Forscher der Metabolomik. Frühere ungezielte Metabolomik-Analysen von Weizengetreide haben Daten aus mehreren chromatographischen Trennungen und Erfassungspolaritäten und/oder Instrumenten für eine größere Metabolomabdeckung kombiniert. Dies erforderte jedoch, dass Proben für jede Modalität einzeln vorbereitet und erworben wurden. So erstellten Beleggia et al.2. 2 zusätzlich zur GC-MS-Analyse der unpolaren Analyten eine derivatisierte Probe für die GC-MS-Analyse von Polaranalyten. Das et al.3 verwendete sowohl GC- als auch LC-MS-Methoden, um die Abdeckung in ihren Analysen zu verbessern; Dieser Ansatz würde jedoch in der Regel getrennte Probenvorbereitungen wie oben beschrieben sowie zwei unabhängige Analyseplattformen erfordern. Frühere Analysen von Weizengetreide mit GC-MS2,3,4 und LC-MS3,5 Plattformen haben 50 bis 412 (55 identifizierte) Funktionen für GC-MS, 409 für kombinierte GC-MS und LC-MS und mehrere tausend für eine LC-MS Lipidomik-Analyse5ergeben. Durch die Kombination von mindestens zwei Modi in einer einzigen Analyse kann eine erweiterte Metabolomabdeckung aufrechterhalten werden, wodurch der Reichtum der biologischen Interpretation erhöht wird und gleichzeitig Zeit- und Kosteneinsparungen erzielt werden.

Um eine effiziente Trennung einer Vielzahl von Lipidarten durch umgekehrte Phasenchromatographie zu ermöglichen, verwenden moderne Lipidomik-Methoden häufig einen hohen Anteil an Isopropanol im Elutionslösungsmittel6, um Lipidklassen, die sonst durch die Chromatographie ungelöst sein könnten, eine Aenbarkeit zu bieten. Für eine effiziente Lipidtrennung ist die startende mobile Phase auch in der organischen Zusammensetzung7 viel höher als die typischen chromatographischen Methoden der umgekehrten Phase, die andere Klassen von Molekülen berücksichtigen. Die hohe organische Zusammensetzung zu Beginn des Gradienten macht diese Methoden weniger geeignet für viele andere Klassen von Molekülen. Vor allem die umgekehrte Phasenflüssigkeitschromatographie verwendet einen binären Lösungsmittelgradienten, beginnend mit einer meist wässrigen Zusammensetzung und einer Erhöhung des organischen Gehalts, da die Elutionsfestigkeit der Chromatographie erhöht wird. Zu diesem Zweck haben wir versucht, die beiden Ansätze zu kombinieren, um die Trennung von Lipid- und Nicht-Lipid-Klassen von Metaboliten in einer einzigen Analyse zu erreichen.

Hier stellen wir eine chromatographische Methode vor, die eine dritte mobile Phase verwendet und eine kombinierte traditionelle umgekehrte Phase und lipidomics-geeignete Chromatographiemethode mit einer einzigen Probenvorbereitung und einer analytischen Spalte ermöglicht. Wir haben viele der Qualitätskontrollmaßnahmen und Datenfilterschritte übernommen, die bisher in überwiegend klinischen Metabolomik-Studien umgesetzt wurden. Diese Ansätze sind nützlich, um robuste Merkmale mit hoher technischer Reproduzierbarkeit und biologischer Relevanz zu bestimmen, und schließen diejenigen aus, die diese Kriterien nicht erfüllen. Zum Beispiel beschreiben wir die Wiederholungsanalyse der gepoolten QC-Probe8, QC-Korrektur9, Datenfilterung9,10 und Imputation fehlender Features11.

Protocol

Diese Methode eignet sich für 30 Proben (ca. 150 Samen pro Probe). Hier wurden drei biologische Nachbildungen von zehn verschiedenen Weizensorten verwendet. 1. Herstellung von Körnern Abrufen von Proben (Ganze Körner) aus -80 °C Lagerung.HINWEIS: Die Gefriertrocknung von Samen wird kurz nach der Ernte empfohlen, wenn Proben aus mehreren Jahreszeiten entnommen werden. Dadurch werden Änderungen der Metabolitenkonzentration minimiert, die nach unterschiedlichen Lagerzeiten auft…

Representative Results

Das Pflanzenmetabolom wird durch eine Kombination seines Genoms und seiner Umwelt beeinflusst, und zusätzlich in einer landwirtschaftlichen Umgebung, dem Pflanzenmanagementregime. Wir zeigen, dass hier genetische Unterschiede zwischen Weizensorten auf Metabolitenebene beobachtet werden können, wobei über 500 gemessene Verbindungen signifikant unterschiedliche Konzentrationen zwischen den Sorten allein im Getreide aufweisen. Eine gute Massengenauigkeit (<10 ppm-Fehler) und die Signalrep…

Discussion

Hier stellen wir eine LC-MS-basierte ungezielte Metabolomik-Methode zur Analyse von Weizengetreide vor. Die Methode kombiniert vier Erfassungsmodi (umgekehrte Phase und lipid-amenable reversed phase mit positiver und negativer Ionisation) in zwei Modi, indem eine dritte mobile Phase in den umgekehrten Phasenverlauf eingeführt wird. Der kombinierte Ansatz ergab etwa 500 biologisch relevante Merkmale pro Ionenpolarität, wobei etwa die Hälfte dieser signifikant unterschiedlichen Intensitäten zwischen Weizensorten aufwei…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten das Landwirtschafts- und Ernährungsstipendium des West australian Premier (Department of Jobs, Tourism, Science and Innovation, Government of Western Australia) und den Premier es Fellow, Professor Simon Cook (Centre for Digitale Landwirtschaft, Curtin University und Murdoch University). Feldversuche und Getreideprobenentnahme wurden von der Regierung des Programms Royalties for Regions in Westaustralien unterstützt. Wir würdigen Grantley Stainer und Robert French für ihre Beiträge zu Feldversuchen. Die von NCRIS finanzierten Bioplattformen Australien sind für die Finanzierung von Ausrüstungen anerkannt.

Materials

13C6-sorbitol Merck Sigma-Aldrich 605514
2-aminoanthracene Merck Sigma-Aldrich A38800-1 g
Acetonitrile ThermoFisher Scientific FSBA955-4 Optima LC-MS grade
Ammonium formate Merck Sigma-Aldrich 516961-100 mL >99.995%
Analyst TF Sciex Version 1.7
AnalyzerPro software SpectralWorks Ltd. Data processing software used for step 7.2. Version 5.7
AnalyzerPro XD sortware SpectralWorks Ltd. Data processing software used for step 7.5. Version 1.4
Balance Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.
d6-transcinnamic acid Isotec 513962-250 mg
Formic acid Ajax Finechem Pty. Ltd. A2471-500 mL 99%
Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) Labconco 7670031
Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L)
Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) Velocity Scientific Solutions VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids)
Installation kit for Sciex TripleToF Sciex p/n 4456736
Isopropanol ThermoFisher Scientific FSBA464-4 Optima LC-MS grade
Laboratory blender Waring commercial Model HGBTWTS3
Leucine-enkephalin Waters p/n 700008842 Tuning solution
Metaboanalyst https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0.
Methanol ThermoFisher Scientific FSBA456-4 Optima LC-MS grade
Miconazole Merck Sigma-Aldrich M3512-1 g
Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) 5426 No. 0021716
Microcentrifuge tubes (2 mL) SSIbio 1310-S0
Microsoft Office Excel Microsoft
Peak View software Sciex Version 1.2 (64-bit)
Pipette tips (200 uL, 100 uL) ThermoFisher Scientific MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)
Pipettes (200 uL, 1000 uL) ThermoFisher Scientific
Plastic centrifuge tubes (15 mL) ThermoFisher Scientific NUN339650
Progenesis QI Nonlinear Dynamics Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit)
Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer Sciex
Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads Bertin Technologies
Sodium formate Merck Sigma-Aldrich 456020-25 g
Tissue lyser/homogeniser Bertin Technologies Serial 0001620
Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)
Vortex mixer IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) 001722
Water ThermoFisher Scientific FSBW6-4 Optima LC-MS grade
Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps Waters
Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column Waters p/n 186005614

References

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  2. Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
  3. Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
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Cite This Article
Abbiss, H., Gummer, J. P. A., Francki, M., Trengove, R. D. Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain. J. Vis. Exp. (157), e60851, doi:10.3791/60851 (2020).

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