गेहूं के अनाज का अलक्षित तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित मेटापोलोमिक्स विश्लेषण
Summary
गेहूं के अनाज मेटाबोलाइट्स और लिपिड के अलक्षित विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है। प्रोटोकॉल में सकारात्मक और नकारात्मक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मोड में अधिग्रहण के साथ एक एसीटोनिट्रिल मेटाबोलाइट निष्कर्षण विधि और रिवर्स्ड चरण तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री पद्धति शामिल है।
Abstract
जीन, पर्यावरण और कृषि अभ्यास में प्रबंधन के बीच बातचीत को समझना अधिक सटीक भविष्यवाणी और उत्पाद उपज और गुणवत्ता के प्रबंधन की अनुमति सकता है । मेटापोलोमिक्स डेटा समय में किसी दिए गए क्षण में इन बातचीत को पढ़ने का प्रावधान करता है और किसी जीव की जैव रासायनिक स्थिति की जानकारीपूर्ण है। इसके अलावा, व्यक्तिगत मेटाबोलाइट्स या मेटाबोलाइट्स के पैनलों का उपयोग उपज और गुणवत्ता भविष्यवाणी और प्रबंधन के लिए सटीक बायोमार्कर के रूप में किया जा सकता है। पौधे मेटाबोलोम में विभिन्न भौतिक रासायनिक गुणों के साथ हजारों छोटे अणुओं को शामिल करने की भविष्यवाणी की गई है जो शारीरिक लक्षणों और बायोमार्कर खोज में जैव रासायनिक अंतर्दृष्टि के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं। इसका फायदा उठाने के लिए, मेटापोलोमिक्स शोधकर्ताओं के लिए एक प्रमुख उद्देश्य एक ही विश्लेषण के भीतर यथासंभव भौतिक रासायनिक विविधता को कैप्चर करना है। यहां हम खेत में उगाए गए गेहूं के अनाज के विश्लेषण के लिए एक तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित अलक्षित मेटापोलोमिक्स विधि प्रस्तुत करते हैं। विधि एक तिहाई मोबाइल चरण शुरू करने के लिए तरल क्रोमेटोग्राफ क्वाटरनेरी सॉल्वेंट प्रबंधक का उपयोग करती है और एक लिपिड-उत्तरदायी ढाल के साथ एक पारंपरिक रिवर्स-चरण ढाल को जोड़ती है। अनाज तैयार करना, मेटाबोलाइट निष्कर्षण, वाद्य विश्लेषण और डेटा प्रसंस्करण कार्यप्रवाह का विस्तार से वर्णन किया गया है। अच्छी मास सटीकता और सिग्नल प्रजनन क्षमता देखी गई, और विधि ने आयनीकरण मोड प्रति लगभग 500 जैविक रूप से प्रासंगिक विशेषताएं प्राप्त कीं। इसके अलावा, गेहूं की किस्मों के बीच काफी अलग मेटाबोलाइट और लिपिड फीचर सिग्नल निर्धारित किए गए थे।
Introduction
कृषि में जीन, पर्यावरण और प्रबंधन प्रथाओं के बीच बातचीत को समझना उत्पाद उपज और गुणवत्ता के अधिक सटीक भविष्यवाणी और प्रबंधन की अनुमति दे सकता है । पौधे मेटाबोलाइट्स जीनोम, पर्यावरण (जलवायु, वर्षा आदि) जैसे कारकों से प्रभावित होते हैं, और कृषि सेटिंग में, जिस तरह से फसलों का प्रबंधन किया जाता है (यानी, उर्वरक, कवकनाशक आदि का अनुप्रयोग)। जीनोम के विपरीत, मेटापोलोम इन सभी कारकों से प्रभावित होता है और इसलिए मेटापोलोमिक्स डेटा एक विशेष समय में इन बातचीत का एक जैव रासायनिक फिंगरप्रिंट प्रदान करता है। आमतौर पर मेटाबोलोमिक्स-आधारित अध्ययन के लिए दो लक्ष्यों में से एक होता है: सबसे पहले, जीव के जैव रसायन की गहरी समझ प्राप्त करने के लिए और शरीर विज्ञान के संबंध में क्षोभ (एबायोटिक या बायोटिक तनाव) के प्रति प्रतिक्रिया के तंत्र को समझाने में मदद करता है; और दूसरा, अध्ययन के तहत क्षोभ के साथ बायोमार्कर को संबद्ध करने के लिए। दोनों ही मामलों में, इस ज्ञान होने का परिणाम बेहतर उपज आकार और गुणवत्ता के लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए एक अधिक सटीक प्रबंधन रणनीति है ।
पौधे के मेताबोलोम में विभिन्न भौतिक रासायनिक गुणों के साथ हजारों1 छोटे अणुओं के शामिल होने की भविष्यवाणी की गई है। वर्तमान में, कोई मेटापोलोमिक्स प्लेटफॉर्म (मुख्य रूप से द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी) एक ही विश्लेषण में पूरे मेटापोलोम को कैप्चर नहीं कर सकता है। इस तरह की तकनीकों (नमूना तैयारी, मेटाबोलाइट निष्कर्षण और विश्लेषण) का विकास करना, जो एक विश्लेषणात्मक रन के भीतर संभव के रूप में मेटाबोलोम का एक बड़ा कवरेज प्रदान करता है, मेटापोलोमिक्स शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण उद्देश्य है। गेहूं के अनाज के पिछले अलक्षित मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण ों में कई क्रोमेटोग्राफिक अलगाव और अधिग्रहण ध्रुवीकरण और/या अधिक मेटापोलोम कवरेज के लिए इंस्ट्रूमेंटेशन से संयुक्त डेटा है । हालांकि, इसके लिए प्रत्येक तौर-तरीकों के लिए अलग से नमूने तैयार करने और प्राप्त करने की आवश्यकता है । उदाहरण के लिए, बेलेगिया एट अल2 ने नॉनपोलर एनालिट्स के जीसी-एमएस विश्लेषण के अलावा ध्रुवीय विश्लेषणों के जीसी-एमएस विश्लेषण के लिए एक व्युत्पन्न नमूना तैयार किया। दास एट अल3 ने अपने विश्लेषण ों में कवरेज में सुधार करने के लिए जीसी और एलसी-एमएस दोनों तरीकों का उपयोग किया; हालांकि, इस दृष्टिकोण को आम तौर पर ऊपर वर्णित अलग नमूना तैयारी के साथ-साथ दो स्वतंत्र विश्लेषणात्मक प्लेटफार्मों की आवश्यकता होगी। जीसी-एमएस2,3,3,4 और एलसी-एमएस3,,5 प्लेटफार्मों का उपयोग करगेहूं अनाज के पिछले विश्लेषणों में जीसी-एमएस के लिए ५० से ४१२ (५५ की पहचान) विशेषताएं, संयुक्त जीसी-एमएस और एलसी-एमएस के लिए ४०९ और एलसी-एमएस लिपिडोमिक्स विश्लेषण5के लिए कई हजार मिले हैं । एक ही विश्लेषण में कम से कम दो मोड के संयोजन से, विस्तारित मेटापोलोम कवरेज को बनाए रखा जा सकता है, जैविक व्याख्या की समृद्धि में वृद्धि करते हुए समय और लागत दोनों में बचत की पेशकश भी की जा सकती है।
रिवर्स-चरण क्रोमेटोग्राफी द्वारा लिपिड प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला के कुशल पृथक्करण की अनुमति देने के लिए, आधुनिक लिपिडोमिक्स पद्धतियां आमतौर पर एल्यूशन सॉल्वेंट6में आइसोप्रोपेनॉल के उच्च अनुपात का उपयोग करती हैं, लिपिड कक्षाओं को एमेनेबिलिटी प्रदान करती हैं जो अन्यथा क्रोमेटोग्राफी द्वारा अनसुलझे हो सकती हैं। एक कुशल लिपिड जुदाई के लिए, शुरुआती मोबाइल चरण विशिष्ट उत्क्रमित चरण क्रोमेटोग्राफिक विधियों की तुलना में कार्बनिक संरचना7 में भी बहुत अधिक है, जो अणुओं के अन्य वर्गों पर विचार करते हैं। ढाल की शुरुआत में उच्च कार्बनिक संरचना इन तरीकों को अणुओं के कई अन्य वर्गों के लिए कम उपयुक्त बनाती है। सबसे विशेष रूप से, उलट चरण तरल क्रोमेटोग्राफी एक बाइनरी सॉल्वेंट ग्रेडिएंट को रोजगार देता है, जो ज्यादातर जलीय संरचना से शुरू होता है और कार्बनिक सामग्री में वृद्धि करता है क्योंकि क्रोमेटोग्राफी की एल्यूशन ताकत बढ़ जाती है। इस उद्देश्य के लिए, हमने एक ही विश्लेषण के भीतर मेटाबोलाइट्स के लिपिड और गैर-लिपिड दोनों वर्गों को अलग करने के लिए दो दृष्टिकोणों को संयोजित करने की मांग की।
यहां, हम एक क्रोमेटोग्राफिक विधि प्रस्तुत करते हैं जो तीसरे मोबाइल चरण का उपयोग करता है और एक एकल नमूना तैयारी और एक विश्लेषणात्मक स्तंभ का उपयोग करके एक संयुक्त पारंपरिक उलट चरण और लिपिडोमिक्स-उपयुक्त क्रोमेटोग्राफी विधि को सक्षम बनाता है। हमने कई गुणवत्ता नियंत्रण उपायों और डेटा फ़िल्टरिंग चरणों को अपनाया है जिन्हें पहले मुख्य रूप से नैदानिक मेटापोलोमिक्स अध्ययनों में लागू किया गया है। ये दृष्टिकोण उच्च तकनीकी प्रजनन क्षमता और जैविक प्रासंगिकता के साथ मजबूत सुविधाओं का निर्धारण करने में उपयोगी हैं और उन मानदंडों को पूरा नहीं करने वालों को शामिल नहीं करते हैं जो इन मानदंडों को पूरा नहीं करते हैं। उदाहरण के लिए, हम पूल किए गए क्यूसी नमूने8,क्यूसी सुधार9,डेटा फ़िल्टरिंग9,,10 और लापता सुविधाओं के आरोपण के दोहराने के विश्लेषण का वर्णन करते हैं11।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हम गेहूं के अनाज के विश्लेषण के लिए एलसी-एमएस आधारित अलक्षित मेतापोलोमिक्स विधि प्रस्तुत करते हैं। विधि उलट चरण ढाल में एक तिहाई मोबाइल चरण शुरू करके सकारात्मक और नकारात्मक आयनीकरण के साथ चार अध…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक पश्चिम ऑस्ट्रेलियाई प्रीमियर के कृषि और खाद्य फैलोशिप कार्यक्रम (नौकरियां, पर्यटन, विज्ञान और नवाचार विभाग, पश्चिमी ऑस्ट्रेलिया सरकार) और प्रीमियर के फेलो, प्रोफेसर साइमन कुक (केंद्र के लिए) को स्वीकार करना चाहते है डिजिटल एग्रीकल्चर, कर्टिन यूनिवर्सिटी और मर्डोक यूनिवर्सिटी) । क्षेत्र परीक्षण ों और अनाज नमूना संग्रह क्षेत्रों कार्यक्रम के लिए पश्चिमी ऑस्ट्रेलिया की रॉयल्टी की सरकार द्वारा समर्थित थे । हम फील्ड परीक्षणों में उनके योगदान के लिए ग्रांटली स्टेनर और रॉबर्ट फ्रेंच को स्वीकार करते हैं। एनसीआरआईएस द्वारा वित्तपोषित बायोप्लेटफॉर्मऑस्ट्रेलिया को उपकरण वित्त पोषण के लिए स्वीकार किया जाता है।
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
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