Umålrettet flytende kromatografi-massespektrometribasert metabolomikkanalyse av hvetekorn
Summary
En metode for umålrettet analyse av hvetekornmetabolitter og lipider presenteres. Protokollen inkluderer en acetonitrile metabolitt ekstraksjonsmetode og reversert fase flytende kromatografi-massespektrometri metodikk, med oppkjøp i positive og negative elektrospray ioniseringmoduser.
Abstract
Å forstå samspillet mellom gener, miljø og forvaltning i landbrukspraksis kan gi mer nøyaktig prediksjon og styring av produktutbytte og kvalitet. Metabolomikkdata gir en avlesning av disse interaksjonene på et gitt tidspunkt og er informativ av organismens biokjemiske status. Videre kan individuelle metabolitter eller paneler av metabolitter brukes som presise biomarkører for utbytte og kvalitetsprediksjon og ledelse. Plantemetabolomen er spådd å inneholde tusenvis av små molekyler med varierte fysikokjemiske egenskaper som gir en mulighet for en biokjemisk innsikt i fysiologiske egenskaper og biomarkøroppdagelse. For å utnytte dette, et viktig mål for metabolomikk forskere er å fange så mye av fysikokjemisk mangfold som mulig innenfor en enkelt analyse. Her presenterer vi en flytende kromatografi-massespektrometribasert umålrettet metabolomikkmetode for analyse av feltdyrket hvetekorn. Metoden bruker flytende kromatograf kvartær løsningsmiddel manager for å introdusere en tredje mobil fase og kombinerer en tradisjonell omvendt fase gradient med en lipid-mottagelig gradient. Kornforberedelse, metabolittutvinning, instrumentell analyse og databehandlingsarbeidsflyter er beskrevet i detalj. God massenøyaktighet og signalreproduserbarhet ble observert, og metoden ga ca. 500 biologisk relevante egenskaper per ioniseringsmodus. Videre ble signifikant forskjellige metabolitter og lipidfunksjonssignaler mellom hvetevarianter bestemt.
Introduction
Å forstå samspillet mellom gener, miljø og ledelsespraksis i landbruket kan gi mer nøyaktig prediksjon og styring av produktutbytte og kvalitet. Plantemetabolitter påvirkes av faktorer som genomet, miljøet (klima, nedbør etc.), og i landbruket, måten avlinger forvaltes (dvs. anvendelse av gjødsel, soppdrepende etc.). I motsetning til genomet påvirkes metabolomet av alle disse faktorene, og dermed gir metabolomikkdata et biokjemisk fingeravtrykk av disse interaksjonene på et bestemt tidspunkt. Det er vanligvis ett av to mål for en metabolomikkbasert studie: for det første for å oppnå en dypere forståelse av organismens biokjemi og bidra til å forklare reaksjonsmekanismen for perturbasjon (abiotisk eller biotisk stress) i forhold til fysiologien; og for det andre, for å knytte biomarkører til perturbasjonen under studien. I begge tilfeller er resultatet av å ha denne kunnskapen en mer presis forvaltningsstrategi for å nå målet om forbedret avkastningsstørrelse og kvalitet.
Plantemetabolomen er spådd å inneholde tusenvisav 1 av små molekyler med varierte fysikokjemiske egenskaper. Foreløpig ingen metabolomics plattformer (overveiende masse spektrometri og kjernefysisk magnetisk resonans spektroskopi) kan fange hele metabolome i en enkelt analyse. Utvikle slike teknikker (prøveforberedelse, metabolittutvinning og analyse), som gir så stor dekning av metabolomet som mulig innenfor en enkelt analytisk løp, er et viktig mål for metabolomikk forskere. Tidligere umålrettede metabolomikkanalyser av hvetekorn har kombinert data fra flere kromatografiske separasjoner og oppkjøpavpolariteter og/eller instrumentering for større metabolomdekning. Dette har imidlertid krevd at prøvene skal tilberedes og anskaffes separat for hver modalitet. Beleggia et al.2 utarbeidet for eksempel et avledet utvalg for GC-MS-analysen av polaranalytter i tillegg til GC-MS-analysen av de ikke-polare analytter. Das et al.3 brukte både GC- og LC-MS-metoder for å forbedre dekningen i sine analyser; Denne tilnærmingen vil imidlertid generelt kreve separate prøvepreparater som beskrevet ovenfor, samt to uavhengige analytiske plattformer. Tidligere analyser av hvetekorn ved hjelp av GC-MS2,3,4 og LC-MS3,5 plattformer har gitt 50 til 412 (55 identifisert) funksjoner for GC-MS, 409 for kombinert GC-MS og LC-MS og flere tusen for en LC-MS lipidomics analyse5. Ved å kombinere minst to moduser i en enkelt analyse, kan utvidet metabolomdekning opprettholdes, noe som øker rikdommen av biologisk tolkning samtidig som den tilbyr besparelser både i tid og kostnad.
For å tillate effektiv separasjon av et bredt spekter av lipidarter ved reversert-fase kromatografi, bruker moderne lipidomics metoder vanligvis en høy andel av isopropanol i elutionløsningsmiddelet6, noe som gir amenability til lipidklasser som ellers kan være uløst av kromatografien. For en effektiv lipidseparasjon er startfasen også mye høyere i organisk sammensetning7 enn de typiske reverserte fasekromatikkene, som vurderer andre klasser av molekyler. Den høye organiske sammensetningen ved starten av gradienten gjør disse metodene mindre egnet for mange andre klasser av molekyler. Spesielt, reversert fase flytende kromatografi benytter en binær løsemiddel gradient, starter med en for det meste vandig sammensetning og øker i organisk innhold som elution styrken av kromatografi en økt. For dette formål forsøkte vi å kombinere de to tilnærmingene for å oppnå separasjon av både lipid- og ikke-lipidklasser av metabolitter i en enkelt analyse.
Her presenterer vi en kromatistisk metode som bruker en tredje mobilfase og muliggjør en kombinert tradisjonell omvendt fase og lipidomikk-passende kromatografimetode ved hjelp av et enkelt prøvepreparat og en analytisk kolonne. Vi har vedtatt mange av kvalitetskontrolltiltak ene og datafiltreringstrinnene som tidligere er implementert i overveiende kliniske metabolomikkstudier. Disse tilnærmingene er nyttige for å bestemme robuste funksjoner med høy teknisk reproduserbarhet og biologisk relevans og utelukker de som ikke oppfyller disse kriteriene. Vi beskriver for eksempel gjentatt analyse av det samlede QC-eksemplet8, QC-korreksjon9,datafiltrering9,,10 og imputering av manglende funksjoner11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenterer vi en LC-MS-basert umålrettet metabolomikkmetode for analyse av hvetekorn. Metoden kombinerer fire anskaffelsesmoduser (omvendt fase og lipid-mottagelig omvendt fase med positiv og negativ ionisering) i to moduser ved å introdusere en tredje mobilfase i omvendt fasegradient. Den kombinerte tilnærmingen ga ca 500 biologisk relevante egenskaper per ion polaritet med omtrent halvparten av disse betydelig forskjellige i intensitet mellom hvetesorter. Betydelige endringer i metabolittkonsentrasjon i kornet …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å anerkjenne West Australian Premier’s Agriculture and Food Fellowship program (Department of Jobs, Tourism, Science and Innovation, Government of Western Australia) og Premier’s Fellow, Professor Simon Cook (Senter for Digitalt landbruk, Curtin University og Murdoch University). Feltforsøk og kornprøvesamling ble støttet av regjeringen i Western Australias royalties for regioner-program. Vi anerkjenner Grantley Stainer og Robert French for deres bidrag til feltforsøk. NCRIS-finansierte Bioplatforms Australia er anerkjent for utstyrsfinansiering.
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
