Oriktad flytande kromatografi-Mass Pektrometri-Baserade metabolomika analys av vetekorn
Summary
En metod för oriktad analys av vetekornmetaboliter och lipider presenteras. Protokollet innehåller en acetonittrile metabolit extraktionmetod och omvänd fas flytande kromatografi-massa spektrometri metodik, med förvärv i positiva och negativa elektrospray jonisering s.k.
Abstract
Att förstå samspelet mellan gener, miljö och förvaltning i jordbrukspraxis skulle kunna möjliggöra mer exakt förutsägelse och hantering av produktavkastning och kvalitet. Metabolomics data ger en avläsning av dessa interaktioner vid en viss tidpunkt och är informativ av en organism biokemiska status. Dessutom kan enskilda metaboliter eller paneler av metaboliter användas som exakta biomarkörer för avkastning och kvalitetsprognos och kvalitetsstyrning. Växtmetabolomen förutspås innehålla tusentals små molekyler med varierande fysicokemiska egenskaper som ger en möjlighet till en biokemisk inblick i fysiologiska egenskaper och biomarkörupptäckt. För att utnyttja detta är ett viktigt mål för metabolomikforskare att fånga så mycket av den fysikokemiska mångfalden som möjligt inom en enda analys. Här presenterar vi en flytande kromatografi-massa spektrometri-baserade oriktade metabolomics metod för analys av fältodlade vetekorn. Metoden använder vätskekromatografen kvartärlösningsmedelshanterare för att införa en tredje mobil fas och kombinerar en traditionell omvänd fasgradient med en lipid-mottaglig gradient. Spannmålsberedning, metabolitutvinning, instrumentell analys och databehandlingsarbetsflöden beskrivs i detalj. God massnoggrannhet och signalreproducerbarhet observerades, och metoden gav cirka 500 biologiskt relevanta funktioner per joniseringsläge. Vidare, betydligt olika metabolit och lipid funktionen signaler mellan vete sorter fastställdes.
Introduction
Att förstå samspelet mellan gener, miljö och förvaltningsmetoder inom jordbruket skulle kunna möjliggöra mer exakt förutsägelse och hantering av produktavkastning och kvalitet. Växtmetaboliter påverkas av faktorer som genom, miljö (klimat, nederbörd etc.), och i en jordbruksmiljö, hur grödor förvaltas (dvs. tillämpning av gödselmedel, fungicid etc.). Till skillnad från genomet påverkas metabolomen av alla dessa faktorer och därför ger metabolomikdata ett biokemiskt fingeravtryck av dessa interaktioner vid en viss tidpunkt. Det finns vanligtvis ett av två mål för en metabolomikbaserad studie: för det första att uppnå en djupare förståelse av organismens biokemi och bidra till att förklara mekanismen för svar på störning (abiotisk eller biotisk stress) i förhållande till fysiologin; för det andra att associera biomarkörer med den störning som är under studie. I båda fallen är resultatet av att ha denna kunskap en mer exakt förvaltningsstrategi för att uppnå målet om förbättrad avkastningsstorlek och kvalitet.
Växtmetabolomen förutspås innehålla tusentals1 av små molekyler med varierande fysicokemiska egenskaper. För närvarande kan inga metabolomics plattformar (främst massa spektrometri och nukleärmagnetisk resonansspektroskopi) fånga hela metabolomen i en enda analys. Att utveckla sådana tekniker (provberedning, metabolitextraktion och analys), som ger en så stor täckning av metabolomen som möjligt inom en enda analytisk körning, är ett viktigt mål för metabolomikforskare. Tidigare oriktade metabolomikanalyser av vetekorn har kombinerat data från flera kromatografiska separationer och förvärvspolariteter och/eller instrumentering för större metabolomtäckning. Detta har dock krävt att prover na bereds och förvärvas separat för varje modalitet. Till exempel, Beleggia et al.2 förberett ett härledda prov för GC-MS analys av polaranalyter utöver GC-MS analys av nonpolar analyter. Das et al.3 använde både GC- och LC-MS-metoder för att förbättra täckningen i sina analyser. Detta tillvägagångssätt skulle dock i allmänhet kräva separata provberedningar enligt beskrivningen ovan samt två oberoende analysplattformar. Tidigare analyser av vetekorn med GC-MS2,,3,,4 och LC-MS3,5 plattformar har gett 50 till 412 (55 identifierade) funktioner för GC-MS, 409 för kombinerade GC-MS och LC-MS och flera tusen för en LC-MS lipidomik analys5. Genom att kombinera minst två lägen till en enda analys kan utökad metabolomtäckning bibehållas, vilket ökar den biologiska tolkningens rikedom samtidigt som det erbjuds besparingar både i tid och kostnad.
För att möjliggöra en effektiv separation av ett brett spektrum av lipidarter genom omvänd fas kromatografi, moderna lipidomik metoder använder ofta en hög andel isopropanol i elutionlösningsmedel6, vilket ger amenability till lipid klasser som annars skulle kunna lösas av kromatografi. För en effektiv lipidseparation är den inledande mobila fasen också mycket högre i organisk sammansättning7 än de typiska omvända faskromatografiska metoderna, som tar hänsyn till andra klasser av molekyler. Den höga organiska sammansättningen i början av lutningen gör dessa metoder mindre lämpliga för många andra klasser av molekyler. Framför allt använder omvänd fas flytande kromatografi en binär lösningsmedelsgradient, som börjar med en mestadels vattenhaltig sammansättning och ökar i organiskt innehåll när kromatografins elutidsstyrka ökas. För detta ändamål försökte vi kombinera de två metoderna för att uppnå separation av både lipid och icke-lipid klasser av metaboliter inom en enda analys.
Här presenterar vi en kromatografisk metod som använder en tredje mobil fas och möjliggör en kombinerad traditionell omvänd fas och lipidomik-lämplig kromatografi metod med hjälp av ett enda prov beredning och en analytisk kolumn. Vi har antagit många av de kvalitetskontrollåtgärder och datafiltreringssteg som tidigare har implementerats i övervägande kliniska metabolomikstudier. Dessa metoder är användbara för att fastställa robusta egenskaper med hög teknisk reproducerbarhet och biologisk relevans och utesluter sådana som inte uppfyller dessa kriterier. Till exempel beskriver vi upprepa analys av poolade QC prov8, QC korrigering9, datafiltrering9,,10 och imputation av saknade funktioner11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi en LC-MS-baserad oriktad metabolomics metod för analys av vetekorn. Metoden kombinerar fyra förvärvslägen (omvänd fas och lipid-mottaglig omvänd fas med positiv och negativ jonisering) i två lägen genom att införa en tredje mobil fas i den omvända fasgradienten. Den kombinerade metoden gav cirka 500 biologiskt relevanta egenskaper per jonpolaritet med ungefär hälften av dessa signifikant olika i intensitet mellan vetesorter. Betydande förändringar i metabolitkoncentrationen i kornet av o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna West Australian Premier’s Agriculture and Food Fellowship program (Institutionen för jobb, turism, vetenskap och innovation, regeringen i västra Australien) och Premier’s Fellow, Professor Simon Cook (Centre for Digitalt jordbruk, Curtin University och Murdoch University). Fältförsök och spannmål urval samling stöddes av regeringen i västra Australiens Royalties for Regions program. Vi erkänner Grantley Stainer och Robert French för deras bidrag till fältförsök. Den NCRIS-finansierade Bioplatforms Australien är erkänd för utrustning finansiering.
Materials
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
