Stimulering af stamcellenicher og vævsregenerering i musehud ved omskiftelig protoporphyrin IX-afhængig fotogenerering af reaktive iltarter in situ

Summary

Formålet med denne protokol er at fremkalde forbigående in vivo-produktion af ikke-dødelige niveauer af reaktive iltarter (ROS) i musehud, hvilket yderligere fremmer fysiologiske reaktioner i vævet.

Abstract

Her beskriver vi en protokol til at inducere omskiftelig in vivo fotogenerering af endogene reaktive iltarter (ROS) i musehud. Denne forbigående produktion af ROS in situ aktiverer effektivt celleproliferation i stamcellenicher og stimulerer vævsregenerering som stærkt manifesteret gennem acceleration af brandheling og hårfollikelvækstprocesser. Protokollen er baseret på en regulerbar fotodynamisk behandling, der behandler vævet med forstadier til det endogene fotosensibilisator protoporphyrin IX og yderligere bestråler vævet med rødt lys under tæt kontrollerede fysisk-kemiske parametre. Samlet set udgør denne protokol et interessant eksperimentelt værktøj til at analysere ROS-biologi.

Introduction

Reaktive iltarter (ROS) er resultatet af den kemiske reduktion af molekylært ilt til dannelse af vand og inkluderer singlet oxygen, superoxidanion, hydrogenperoxid og hydroxylradikalet ^1,2,3. ROS har en meget kort levetid på grund af deres ekstremt kemiske reaktive natur. I aerobe organismer dannes ROS tilfældigvis inde i cellerne som et stort utæt biprodukt af aerob respiration (elektrontransportkæde) i mitokondrierne. Forbigående akkumulering af høje niveauer af ROS i cellen resulterer i en oxidativ stresstilstand, der kan fremkalde irreversibel inaktivering af proteiner, lipider og sukkerarter og introduktion af mutationer i DNA-molekylet 2,3,4,5. Den gradvise akkumulering af oxidativ skade i celler, væv og hele organismer stiger støt med tiden og har været forbundet med induktion af celledødsprogrammer, flere patologier og aldringsprocessen 2,3,4,6.

Aerobe organismer har støt udviklet effektive molekylære mekanismer til at tackle overskydende ROS-akkumulering i celler og væv. Disse mekanismer omfatter medlemmer af superoxiddismutase (SOD) proteinfamilien, som katalyserer superoxidradikal dismutation til molekylært ilt og hydrogenperoxid, samt forskellige katalaser og peroxidaser, der bruger antioxidantpuljen (glutathion, NADPH, peroxiredoxin, thioredoxin ^7,8) til at katalysere den efterfølgende omdannelse af hydrogenperoxid til vand og molekylært oxygen.

Imidlertid understøtter flere rapporter ROS’s rolle som nøglekomponenter i molekylære kredsløb, der regulerer kritiske cellefunktioner, herunder spredning, differentiering og mobilitet ^2,3,4. Dette koncept understøttes yderligere af den indledende identifikation og karakterisering af dedikerede ROS-producerende mekanismer i aerobe organismer, herunder lipoxygenaser cyclooxygenaser og NADPH-oxidaser ^9,10. I denne forstand udviser ROS en aktiv rolle under hvirveldyrs embryoudvikling 11,12,13, og nøgleroller for disse molekyler i reguleringen af specifikke in vivo fysiologiske funktioner er blevet rapporteret i forskellige eksperimentelle systemer, herunder differentieringsprogrammet for hæmatopoietiske forfædre i Drosophila^14, helbredende induktion i zebrafisk eller haleregenerering i Xenopus haletudser ¹⁵. Hos pattedyr har ROS været involveret i neurale stamcellers selvfornyelse/differentieringspotentiale i en neurosfæremodel¹⁶ og i dereguleringen af tarmens stamcellefunktion under initiering af kolorektal cancer¹⁷. I huden har ROS-signalering været forbundet med epidermal differentiering og regulering af hudens stamcelleniche og hårsækkens vækstcyklus^18,19.

I dette perspektiv er en væsentlig eksperimentel begrænsning for at bestemme ROS’s fysiologiske roller i biologiske systemer, både under normale eller patologiske forhold, manglen på tilstrækkelige eksperimentelle værktøjer til at inducere kontrolleret produktion af disse molekyler i celler og væv, der nøjagtigt ligner deres fysiologiske produktion som anden signalbudbringer. På nuværende tidspunkt involverer de fleste eksperimentelle tilgange administration af eksogen ROS, hovedsagelig i form af hydrogenperoxid. Vi har for nylig implementeret en eksperimentel tilgang til at tænde for en forbigående, ikke-dødelig in vivo-produktion af endogen ROS i musehuden baseret på administration af forstadier til det endogene fotosensibilisator protoporphyrin IX (PpIX; f.eks. aminolaevulinsyre eller dets methylderivat methylaminolevulinat) og yderligere bestråling af prøven med rødt lys for at inducere in situ-dannelse af ROS fra intracellulært molekylært ilt (figur 1). Denne fotodynamiske procedure kan effektivt anvendes til at stimulere residente stamcellenicher og dermed aktivere vævets regenerative programmer^19,20 og åbne vejen for nye terapeutiske modaliteter inden for hudregenerativ medicin. Her præsenterer vi en detaljeret beskrivelse af protokollen, der viser repræsentative eksempler på stimulering af stamcellenicher, målt som en stigning i antallet af langsigtede 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU) etiketfastholdende celler (LRC’er) i udbulningsområdet i hårsækken^19,21 og efterfølgende aktivering af regenereringsprogrammer (acceleration af hårvækst og brandhelingsprocesser) induceret af forbigående^, ikke-dødelig ROS-produktion i huden på C57Bl6-musestammen.

Protocol

Alle musehold og forsøg skal udføres i overensstemmelse med lokal, national, international lovgivning og retningslinjer for dyreforsøg. 1. Induktion af hårvækst, forbrænding, induktion og identifikation af langsigtede BrdU LRC’er i hele halehudens epitel BEMÆRK: Brug 10 dage eller 7 uger gamle C57BL/6-mus, helst kuldkammerater, til de eksperimentelle designs, der er beskrevet nedenfor. I alle forsøgsprocedurer vil dyrene blive bedøvet ved 3% isofluranindåndi…

Representative Results

Topisk administration af mALA-prækursoren i musens ryg- og halehud resulterer i en signifikant ophobning af PpIX i hele vævet og mærkbart i hårsækken, som demonstreret ved den rødlig-lyserøde fluorescens af denne forbindelse under blåt lys (407 nm) excitation (figur 2A,C). Efterfølgende bestråling af behandlet væv med rødt lys (636 nm) ved en fluens på 2,5-4 J/cm2 fremmer forbigående produktion af ROS i vævet, især i hårsækkens buleområde (<stro…

Discussion

Her præsenterer vi en metode, der tillader en forbigående aktivering af endogen ROS-produktion in vivo i musehud med fysiologiske virkninger. Metoden er baseret på en fotodynamisk procedure til at inducere en kontrolleret og lokal stimulering af det endogene fotosensibilisator PpIX (figur 1B). Denne eksperimentelle tilgang er et interessant værktøj til at studere ROS-biologi i in vivo-eksperimentelle systemer, der udgør et betydeligt fremskridt i forhold til metoder, der bruger ekstern…

Materials

2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA