גירוי נישות תאי גזע והתחדשות רקמות בעור עכבר על ידי פוטוגנרציה תלוית פרוטופורפירין IX ניתנת להחלפה של מיני חמצן תגובתי באתרם

Summary

מטרת פרוטוקול זה היא לגרום לייצור חולף in vivo של רמות לא קטלניות של מיני חמצן תגובתי (ROS) בעור העכבר, ולקדם עוד יותר תגובות פיזיולוגיות ברקמה.

Abstract

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להשראת פוטוגנרציה ניתנת להחלפה in vivo של מיני חמצן תגובתי אנדוגני (ROS) בעור עכבר. ייצור חולף זה של ROS באתרו מפעיל ביעילות את התפשטות התאים בגומחות תאי גזע וממריץ התחדשות רקמות המתבטאת בחוזקה באמצעות האצת ריפוי כוויות ותהליכי צמיחת זקיקי שיער. הפרוטוקול מבוסס על טיפול פוטודינמי מווסת המטפל ברקמה עם קודמנים של הפוטונסיטייזר האנדוגני פרוטופורפירין IX ומקרין עוד יותר את הרקמה באור אדום תחת פרמטרים פיסיקוכימיים מבוקרים היטב. בסך הכל, פרוטוקול זה מהווה כלי ניסויי מעניין לניתוח הביולוגיה של ROS.

Introduction

מיני חמצן תגובתי (ROS) הם תוצאה של חיזור כימי של חמצן מולקולרי ליצירת מים, וכוללים חמצן סינגלט, אניון סופראוקסיד, מי חמצן ורדיקל הידרוקסיל ^1,2,3. ל-ROS יש תוחלת חיים קצרה מאוד בשל אופיים הריאקטיבי הכימי ביותר. באורגניזמים אירוביים, ROS נוצרים באופן מקרי בתוך התאים כתוצר לוואי דולף עיקרי של נשימה אירובית (שרשרת הובלת אלקטרונים) במיטוכונדריה. הצטברות חולפת של רמות גבוהות של ROS בתא גורמת למצב של עקה חמצונית שעלולה לעורר השבתה בלתי הפיכה של חלבונים, שומנים וסוכרים והכנסת מוטציות במולקולת הדנ”א 2,3,4,5. ההצטברות ההדרגתית של נזקי חמצון בתאים, רקמות ואורגניזמים שלמים עולה בהתמדה עם הזמן ונקשרה להשראת תוכניות מוות תאי, מספר פתולוגיות ותהליך ההזדקנות 2,3,4,6.

אורגניזמים אירוביים פיתחו בהתמדה מנגנונים מולקולריים יעילים כדי להתמודד עם הצטברות עודפת של ROS בתאים וברקמות. מנגנונים אלה כוללים חברים במשפחת החלבונים סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD), אשר מזרזים את פירוק רדיקלי סופראוקסיד לחמצן מולקולרי ומי חמצן, כמו גם קטלזות ופרוקסידאזות שונות המשתמשות במאגר נוגדי החמצון (גלוטתיון, NADPH, פרוקסירדוקסין, תיורדוקסין ^7,8) כדי לזרז את ההמרה הבאה של מי חמצן למים ולחמצן מולקולרי.

עם זאת, מספר דוחות תומכים בתפקיד של ROS כרכיבי מפתח של מעגלים מולקולריים המווסתים תפקודי תאים קריטיים, כולל התפשטות, התמיינות וניידות ^2,3,4. תפיסה זו נתמכת גם על ידי זיהוי ואפיון ראשוני של מנגנונים ייעודיים לייצור ROS באורגניזמים אירוביים, כולל lipoxygenases cyclooxygenases ו- NADPH oxidases ^9,10. במובן זה, ROS ממלאים תפקיד פעיל במהלך התפתחות עוברים בעלי חוליות 11,12,13 ותפקידי מפתח עבור מולקולות אלה בוויסות תפקודים פיזיולוגיים ספציפיים in vivo דווחו במערכות ניסוי שונות, כולל תוכנית התמיינות של אבות המטופויטיים בדרוזופילה¹⁴, השראת ריפוי בדגי זברה^, או התחדשות זנב בראשנים של קסנופוס ¹⁵. ביונקים, ROS היה מעורב בפוטנציאל ההתחדשות העצמית / התמיינות של תאי גזע עצביים במודל נוירוספרה¹⁶ ובדה-רגולציה של תפקוד תאי גזע במעי במהלך התחלת סרטן המעי הגס¹⁷. בעור, איתות ROS נקשר להתמיינות אפידרמיס ולוויסות נישת תאי גזע העור ומחזור צמיחת זקיק השערה^18,19.

מנקודת מבט זו, מגבלה ניסיונית עיקרית לקביעת התפקידים הפיזיולוגיים של ROS במערכות ביולוגיות, הן בתנאים נורמליים והן בתנאים פתולוגיים, היא היעדר כלים ניסיוניים מתאימים כדי לגרום לייצור מבוקר של מולקולות אלה בתאים וברקמות, הדומות במדויק לייצור הפיזיולוגי שלהן כשליחי איתות שני. כיום, רוב הגישות הניסיוניות כוללות מתן ROS אקסוגני, בעיקר בצורה של מי חמצן. לאחרונה יישמנו גישה ניסיונית להפעלת ייצור invivo ארעי ולא קטלני של ROS אנדוגני בעור העכבר, המבוססת על מתן מבשרי הפוטוגנזה פרוטופורפירין IX (PpIX; למשל, חומצה אמינולאבולינית או נגזרת המתיל שלה מתילאמינולבולינאט) והקרנה נוספת של הדגימה באור אדום כדי לגרום להיווצרות באתרו של ROS מחמצן מולקולרי תוך-תאי (איור 1). הליך פוטודינמי זה עשוי לשמש ביעילות כדי לעורר נישות תאי גזע תושבים, ובכך להפעיל את תוכניות ההתחדשות של הרקמה^19,20 ולפתוח את הדרך לשיטות טיפוליות חדשות ברפואה רגנרטיבית של העור. כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של הפרוטוקול, המציג דוגמאות מייצגות של גירוי של נישות תאי גזע, שנמדדו כעלייה במספר התאים השומרים על תווית 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) לטווח ארוך (LRCs) באזור הבליטה של זקיק השערה^19,21, ולאחר מכן הפעלה של תוכניות התחדשות (האצת צמיחת שיער ותהליכי ריפוי כוויות) המושרה על ידי חולף^, ייצור ROS לא קטלני בעור של זן עכבר C57Bl6.

Protocol

כל הליכי גידול העכבר והניסויים חייבים להתבצע בהתאם לחקיקה המקומית, הלאומית, הבינלאומית ולהנחיות בנושא ניסויים בבעלי חיים. 1. השראת צמיחת שיער, השראת כוויות וזיהוי של BrdU LRCs ארוכי טווח באפיתל עור הזנב הערה: יש להשתמש בעכברי C57BL/6 בני 10 ימים או 7 שבועות, רצוי כעכברי ?…

Representative Results

מתן מקומי של קודמן mALA בעור הגב והזנב של העכבר גורם להצטברות משמעותית של PpIX בכל הרקמה, ובאופן ניכר, בזקיק השערה, כפי שמודגם על-ידי הפלואורסצנטיות הוורודה-אדמדמה של התרכובת הזו תחת עירור אור כחול (407 ננומטר) (איור 2A,C). הקרנה עוקבת של רקמה מטופלת באור אדום (636 ננומטר) בשט?…

Discussion

כאן, אנו מציגים מתודולוגיה המאפשרת הפעלה חולפת של ייצור ROS אנדוגני in vivo בעור עכבר עם השפעות פיזיולוגיות. המתודולוגיה מבוססת על הליך פוטודינמי לגרימת גירוי מבוקר ומקומי של הפוטונסיטייזר האנדוגני PpIX (איור 1B). גישה ניסויית זו היא כלי מעניין לחקר הביולוגיה של ROS במערכות ניסויי?…

Materials

2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA