활성 산소 종의 전환 가능한 protoporphyrin IX 의존성 광생성에 의한 마우스 피부의 줄기 세포 틈새 및 조직 재생 자극 in situ
Summary
이 프로토콜의 목적은 마우스 피부에서 치명적이지 않은 수준의 활성 산소 종(ROS)의 일시적인 생체 내 생산을 유도하여 조직의 생리적 반응을 더욱 촉진하는 것입니다.
Abstract
여기에서 우리는 마우스 피부에서 내인성 활성 산소 종(ROS)의 전환 가능한 생체 내 광생성을 유도하는 프로토콜을 설명합니다. ROS의 이러한 일시적인 현장 생산은 줄기 세포 틈새에서 세포 증식을 효율적으로 활성화하고 화상 치유 및 모낭 성장 과정의 가속화를 통해 강력하게 나타나는 조직 재생을 자극합니다. 이 프로토콜은 내인성 감광제인 프로토포르피린 IX의 전구체로 조직을 치료하고 엄격하게 제어되는 물리화학적 매개변수 하에서 조직에 적색광을 추가로 조사하는 조절 가능한 광역학 치료를 기반으로 합니다. 전반적으로 이 프로토콜은 ROS 생물학을 분석하는 흥미로운 실험 도구를 구성합니다.
Introduction
활성 산소종(ROS)은 분자 산소가 화학적으로 환원되어 물을 형성한 결과이며 일중항 산소, 슈퍼옥사이드 음이온, 과산화수소 및 하이드록실 라디칼 1,2,3을 포함합니다. ROS는 화학적 반응성이 매우 높기 때문에 수명이 매우 짧습니다. 호기성 유기체에서 ROS는 미토콘드리아에서 호기성 호흡(전자 수송 사슬)의 주요 누출 부산물로서 세포 내부에 부수적으로 형성됩니다. 세포에 높은 수준의 ROS가 일시적으로 축적되면 단백질, 지질 및 당의 돌이킬 수 없는 비활성화와 DNA 분자 2,3,4,5에 돌연변이가 도입될 수 있는 산화 스트레스 상태가 발생합니다. 세포, 조직 및 전체 유기체에서 산화적 손상의 점진적인 축적은 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가하며 세포 사멸 프로그램의 유도, 여러 병리 및 노화 과정과 관련이 있다 2,3,4,6.
호기성 유기체는 세포와 조직의 과도한 ROS 축적을 해결하기 위해 효율적인 분자 메커니즘을 꾸준히 발전시켜 왔습니다. 이러한 메커니즘에는 슈퍼옥사이드 라디칼 분해를 분자 산소 및 과산화수소로 촉매하는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 단백질 패밀리의 구성원과 항산화 풀(글루타티온, NADPH, 퍼옥시레독신, 티오레독신 7,8)을 사용하여 과산화수소가 물 및 분자 산소로 전환되는 것을 촉매하는 다양한 카탈라아제 및 과산화효소가 포함됩니다.
그러나 여러 보고서는 증식, 분화 및 이동성을 포함하여 중요한 세포 기능을 조절하는 분자 회로의 핵심 구성 요소로서 ROS의 역할을 지지합니다 2,3,4. 이 개념은 리폭시게나제, 사이클로옥시게나제 및 NADPH 산화효소 9,10을 포함한 호기성 유기체에서 전용 ROS 생성 메커니즘의 초기 식별 및 특성화에 의해 추가로 뒷받침됩니다. 이러한 의미에서 ROS는 척추동물 배아 발달 동안 적극적인 역할을 나타내며 11,12,13 특정 생체 내 생리학적 기능의 조절에서 이러한 분자의 핵심 역할은 초파리14의 조혈 전구체의 분화 프로그램, 제브라피쉬의 치유 유도 또는 제노푸스 올챙이 15의 꼬리 재생을 포함한 다양한 실험 시스템에서 보고되었습니다 . 포유류에서 ROS는 신경구 모델16에서 신경 줄기 세포의 자가 재생/분화 잠재력과 대장암 개시17 동안 장 줄기 세포 기능의 조절 완화에 관여했습니다. 피부에서, ROS 신호전달은 표피 분화 및 피부 줄기 세포 틈새 및 모낭 성장 주기의 조절과 관련이 있다18,19.
이러한 관점에서, 정상 또는 병리학적 조건 모두에서 생물학적 시스템에서 ROS의 생리학적 역할을 결정하기 위한 주요 실험적 한계는 세포와 조직에서 이러한 분자의 제어된 생산을 유도하기 위한 적절한 실험 도구가 부족하다는 것입니다. 현재 대부분의 실험적 접근법은 대부분 과산화수소 형태의 외인성 ROS를 투여하는 것입니다. 우리는 최근 내인성 광감작제 프로토포르피린 IX(PpIX; 예: 아미노라에불린산 또는 그 메틸 유도체 메틸아미노레불리네이트)의 전구체 투여를 기반으로 마우스 피부에서 내인성 ROS의 일시적이고 치명적이지 않은 생체 내 생산을 전환하고 세포 내 분자 산소로부터 ROS의 현장 형성을 유도하기 위해 샘플에 적색광을 추가로 조사하는 실험적 접근 방식을 구현했습니다(그림 1). 이러한 광역학 절차는 상주하는 줄기 세포 틈새를 자극하는 데 효율적으로 사용될 수 있으며, 따라서 조직(19,20)의 재생 프로그램을 활성화하고 피부 재생 의학에서 새로운 치료 양식을 위한 길을 열어줍니다. 여기에서는 모낭의 팽창 영역에서 장기 5-브로모-2′-데옥시유리딘(BrdU) 표지 유지 세포(LRC)의 수의 증가로 측정된 줄기 세포 틈새 자극의 대표적인 예를 보여주는 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제시합니다19,21, 및 일시적인 현상에 의해 유도된 재생 프로그램의 후속 활성화(모발 성장 및 화상 치유 과정의 가속화), C57Bl6 마우스 균주의 피부에서 치명적이지 않은 ROS 생성.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 생리학적 효과와 함께 마우스 피부에서 생체 내에서 내인성 ROS 생산의 일시적인 활성화를 허용하는 방법론을 제시합니다. 이 방법론은 내인성 광감작제 PpIX의 제어된 국소 자극을 유도하기 위한 광역학 절차를 기반으로 합니다(그림 1B). 이 실험적 접근 방식은 외부 ROS 소스(일반적으로 과산화수소)를 사용하고 조직/샘플에서 ROS의 제어된 국소 생산을 허용?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 스페인의 Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 to JE) 및 Instituto de Salud Carlos III (PI15 / 01458 to JE)의 보조금으로 지원되었습니다. EC는 Atracción de Talento Investigador 보조금 2017-T2 / BMD-5766 (Comunidad de Madrid 및 UAM)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma Aldrich | D6883-50MG | |
| 5'-bromo-2'-deoxiuridine | Sigma Aldrich | B5002-500MG | |
| Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein | Roche | 11202693001 | |
| Depilatory cream (e.g., Veet) | Veet | ||
| Dihydroethidium | Sigma Aldrich | 37291-25MG | |
| In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2 | Perkin Elmer | ||
| mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g | Galderma | ||
| Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D) | ThorLabs | ||
| Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp | Photocure ASA |
References
- Blázquez-Castro, A. Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology. Redox Biology. 13, 39-59 (2017).
- Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Bartosz, G. Reactive oxygen species: Destroyers or messengers. Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).
- Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Medical Weekly. 142, 13659 (2012).
- Speakman, J. R., Selman, C. The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan. BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).
- Fernandez, V., Videla, L. A. Biochemical aspects of cellular antioxidant systems. Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).
- Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes. Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. -. H. The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology. Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).
- Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).
- Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. Reactive oxygen species: A radical role in development. Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).
- Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active. 발생학. 320 (1), 1-11 (2008).
- Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses. Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).
- Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation. Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).
- Love, N. R., et al. Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration. Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).
- Le Belle, J. E., et al. Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner. Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).
- Myant, K. B., et al. production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
- Hamanaka, R. B., et al. Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development. Science Signaling. 6 (261), 8 (2013).
- Carrasco, E., et al. Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).
- Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, &. #. 1. 9. 3. ;., Espada, J. Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues. Methods. , 109 (2016).
- Braun, K. M., et al. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hsu, Y. -. C., Li, L., Fuchs, E. Emerging interactions between skin stem cells and their niches. Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).
- Plikus, M. V., et al. Epithelial stem cells and implications for wound repair. Seminars in Cell & Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).
