Stimulering av stamcellenisjer og vevregenerering i musehud ved byttbar protoporfyrin IX-avhengig fotogenerering av reaktive oksygenarter in situ

Summary

Målet med denne protokollen er å indusere transient in vivo produksjon av ikke-dødelige nivåer av reaktive oksygenarter (ROS) i musehud, noe som ytterligere fremmer fysiologiske responser i vevet.

Abstract

Her beskriver vi en protokoll for å indusere byttbar in vivo fotogenerering av endogene reaktive oksygenarter (ROS) i musehud. Denne forbigående produksjonen av ROS in situ aktiverer effektivt celleproliferasjon i stamcellenisjer og stimulerer vevregenerering som sterkt manifestert gjennom akselerasjon av brannheling og hårsekkvekstprosesser. Protokollen er basert på en regulerbar fotodynamisk behandling som behandler vevet med forløpere til den endogene fotosensibilisatoren protoporfyrin IX og videre bestråler vevet med rødt lys under tett kontrollerte fysisk-kjemiske parametere. Samlet sett utgjør denne protokollen et interessant eksperimentelt verktøy for å analysere ROS-biologi.

Introduction

Reaktive oksygenarter (ROS) er resultatet av kjemisk reduksjon av molekylært oksygen for å danne vann, og inkluderer singlet oksygen, superoksidanion, hydrogenperoksid og hydroksylradikalet ^1,2,3. ROS har svært kort levetid på grunn av deres ekstremt kjemiske reaktive natur. I aerobe organismer dannes ROS tilfeldigvis inne i cellene som et stort lekkende biprodukt av aerob respirasjon (elektrontransportkjede) i mitokondriene. Forbigående akkumulering av høye nivåer av ROS i cellen resulterer i en oksidativ stresstilstand som kan provosere irreversibel inaktivering av proteiner, lipider og sukkerarter og innføring av mutasjoner i DNA-molekylet 2,3,4,5. Den gradvise akkumuleringen av oksidativ skade i celler, vev og hele organismer øker jevnt med tiden og har vært assosiert med induksjon av celledødsprogrammer, flere patologier og aldringsprosessen 2,3,4,6.

Aerobe organismer har stadig utviklet effektive molekylære mekanismer for å takle overflødig ROS-akkumulering i celler og vev. Disse mekanismene inkluderer medlemmer av superoksiddismutase (SOD) proteinfamilien, som katalyserer superoksydradikaldismutasjon til molekylært oksygen og hydrogenperoksid, samt forskjellige katalaser og peroksidaser som bruker antioksidantbassenget (glutation, NADPH, peroksiredoksin, tioredoksin ^7,8) for å katalysere den påfølgende omdannelsen av hydrogenperoksid til vann og molekylært oksygen.

Imidlertid støtter flere rapporter rollen som ROS som nøkkelkomponenter i molekylære kretser som regulerer kritiske cellefunksjoner, inkludert spredning, differensiering og mobilitet ^2,3,4. Dette konseptet støttes videre av den første identifiseringen og karakteriseringen av dedikerte ROS-produserende mekanismer i aerobe organismer, inkludert lipoksygenaser, cyklooksygenaser og NADPH-oksidaser ^9,10. I denne forstand viser ROS en aktiv rolle under vertebratembryoutvikling 11,12,13 og nøkkelroller for disse molekylene i reguleringen av spesifikke in vivo fysiologiske funksjoner har blitt rapportert i forskjellige eksperimentelle systemer, inkludert differensieringsprogrammet for hematopoietiske forfedre i Drosophila^14, helbredende induksjon i sebrafisk eller haleregenerering i Xenopus rumpetroll ¹⁵. Hos pattedyr har ROS vært involvert i selvfornyelses-/differensieringspotensialet til nevrale stamceller i en nevrosfæremodell¹⁶ og i dereguleringen av intestinal stamcellefunksjon under oppstart av kolorektal kreft¹⁷. I huden har ROS-signalering vært assosiert med epidermal differensiering og regulering av hudens stamcellenisje og hårsekkens vekstsyklus^18,19.

I dette perspektivet er en stor eksperimentell begrensning for å bestemme de fysiologiske rollene til ROS i biologiske systemer, både under normale eller patologiske forhold, mangelen på tilstrekkelige eksperimentelle verktøy for å indusere kontrollert produksjon av disse molekylene i celler og vev, som nøyaktig ligner deres fysiologiske produksjon som andre signalbudbringere. For tiden involverer de fleste eksperimentelle tilnærminger administrering av eksogen ROS, hovedsakelig i form av hydrogenperoksid. Vi har nylig implementert en eksperimentell tilnærming for å slå på en forbigående, ikke-dødelig in vivo produksjon av endogen ROS i musehuden, basert på administrering av forløpere til den endogene fotosensibilisatoren protoporfyrin IX (PpIX; f.eks. aminolevulinsyre eller dets metylderivat metylaminolevulinat) og ytterligere bestråling av prøven med rødt lys for å indusere in situ-dannelsen av ROS fra intracellulært molekylært oksygen (figur 1). Denne fotodynamiske prosedyren kan effektivt brukes til å stimulere residente stamcellenisjer, og dermed aktivere vevets regenerative programmer^19,20 og åpne veien for nye terapeutiske modaliteter i hudregenerativ medisin. Her presenterer vi en detaljert beskrivelse av protokollen, som viser representative eksempler på stimulering av stamcellenisjer, målt som en økning i antall langsiktige 5-brom-2′-deoksyuridin (BrdU) etikettholderceller (LRC) i hårsekkens buleområde^19,21, og påfølgende aktivering av regenereringsprogrammer (akselerasjon av hårvekst og brennhelingsprosesser) indusert av forbigående^, ikke-dødelig ROS-produksjon i huden av C57Bl6 musestamme.

Protocol

Alle prosedyrer for musehold og forsøk skal gjennomføres i samsvar med lokalt, nasjonalt, internasjonalt lovverk og retningslinjer for dyreforsøk. 1. Induksjon av hårvekst, brenninduksjon og identifisering av langsiktige BrdU LRC i halehudepitelet MERK: Bruk 10-dagers eller 7-ukers gamle C57BL/6-mus, helst kullkamerater, for de eksperimentelle designene beskrevet nedenfor. I alle eksperimentelle prosedyrer vil dyrene bli bedøvet ved 3% isofluran inhalasjon eller …

Representative Results

Lokal administrasjon av mALA-forløperen i musens rygg- og halehud resulterer i en signifikant akkumulering av PpIX i hele vevet og, merkbart, i hårsekken, som demonstrert ved rødlig-rosa fluorescens av denne forbindelsen under eksitasjon av blått lys (407 nm) (figur 2A,C). Etterfølgende bestråling av behandlet vev med rødt lys (636 nm) ved en fluence på 2,5-4 J/cm 2 fremmer forbigående produksjon av ROS i vevet, spesielt i utbulningsområdet i hårsekken (<strong cl…

Discussion

Her presenterer vi en metodikk som tillater en forbigående aktivering av endogen ROS-produksjon in vivo i musehud med fysiologiske effekter. Metodikken er basert på en fotodynamisk prosedyre for å indusere en kontrollert og lokal stimulering av det endogene fotosensibilisatoren PpIX (figur 1B). Denne eksperimentelle tilnærmingen er et interessant verktøy for å studere ROS-biologi i in vivo eksperimentelle systemer som utgjør et betydelig fremskritt i forhold til metoder ved bruk av ek…

Materials

2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA