Estimulación de nichos de células madre y regeneración de tejidos en piel de ratón mediante fotogeneración in situ dependiente de protoporfirina IX conmutable de especies reactivas de oxígeno

Summary

El objetivo de este protocolo es inducir la producción transitoria in vivo de niveles no letales de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la piel del ratón, promoviendo aún más las respuestas fisiológicas en el tejido.

Abstract

Aquí, describimos un protocolo para inducir la fotogeneración conmutable in vivo de especies endógenas reactivas de oxígeno (ROS) en la piel del ratón. Esta producción transitoria de ROS in situ activa eficientemente la proliferación celular en nichos de células madre y estimula la regeneración de tejidos, como se manifiesta fuertemente a través de la aceleración de los procesos de curación de quemaduras y crecimiento del folículo piloso. El protocolo se basa en un tratamiento fotodinámico regulable que trata el tejido con precursores del fotosensibilizador endógeno protoporfirina IX y posteriormente irradia el tejido con luz roja bajo parámetros fisicoquímicos estrictamente controlados. En general, este protocolo constituye una herramienta experimental interesante para analizar la biología de las ROS.

Introduction

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son el resultado de la reducción química del oxígeno molecular para formar agua, e incluyen oxígeno singlete, anión superóxido, peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo ^1,2,3. Las ROS tienen una vida útil muy corta debido a su naturaleza extremadamente reactiva químicamente. En los organismos aeróbicos, las ROS se forman incidentalmente dentro de las células como un subproducto permeable importante de la respiración aeróbica (cadena de transporte de electrones) en las mitocondrias. La acumulación transitoria de altos niveles de ROS en la célula da lugar a una condición de estrés oxidativo que puede provocar la inactivación irreversible de proteínas, lípidos y azúcares y la introducción de mutaciones en la molécula de ADN 2,3,4,5. La acumulación gradual de daño oxidativo en células, tejidos y organismos enteros aumenta constantemente con el tiempo y se ha asociado con la inducción de programas de muerte celular, diversas patologías y el proceso de envejecimiento 2,3,4,6.

Los organismos aeróbicos han desarrollado constantemente mecanismos moleculares eficientes para hacer frente a la acumulación excesiva de ROS en células y tejidos. Estos mecanismos incluyen miembros de la familia de proteínas superóxido dismutasa (SOD), que catalizan la dismutación de radicales superóxido en oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno, así como diferentes catalasas y peroxidasas que utilizan el grupo de antioxidantes (glutatión, NADPH, peroxirredoxina, tiorredoxina ^7,8) para catalizar la posterior conversión del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno molecular.

Sin embargo, varios informes apoyan el papel de las ROS como componentes clave de los circuitos moleculares que regulan las funciones celulares críticas, incluyendo la proliferación, la diferenciación y la movilidad ^2,3,4. Este concepto se ve respaldado por la identificación y caracterización inicial de mecanismos específicos de producción de ROS en organismos aeróbicos, incluidas las lipoxigenasas, las ciclooxigenasas y las NADPH oxidasas ^9,10. En este sentido, las ROS exhiben un papel activo durante el desarrollo embrionario de vertebrados 11,12,13 y se han reportado roles clave para estas moléculas en la regulación de funciones fisiológicas específicas in vivo en diferentes sistemas experimentales, incluyendo el programa de diferenciación de progenitores hematopoyéticos en Drosophila^14, la inducción de la cicatrización en el pez cebra o la regeneración de la cola en renacuajos de Xenopus ¹⁵. En mamíferos, las ROS han estado implicadas en el potencial de autorrenovación/diferenciación de las células madre neurales en un modelo de neurosfera¹⁶ y en la desregulación de la función de las células madre intestinales durante el inicio del cáncer colorrectal¹⁷. En la piel, la señalización de ROS se ha asociado con la diferenciación epidérmica y la regulación del nicho de células madre de la piel y el ciclo de crecimiento del folículo piloso^18,19.

En esta perspectiva, una limitación experimental importante para determinar el papel fisiológico de las ROS en los sistemas biológicos, tanto en condiciones normales como patológicas, es la falta de herramientas experimentales adecuadas para inducir la producción controlada de estas moléculas en células y tejidos, asemejándose con precisión a su producción fisiológica como segundos mensajeros de señalización. En la actualidad, la mayoría de los enfoques experimentales implican la administración de ROS exógenas, principalmente en forma de peróxido de hidrógeno. Recientemente hemos implementado un enfoque experimental para activar una producción in vivo transitoria y no letal de ROS endógenas en la piel del ratón, basada en la administración de precursores del fotosensibilizador endógeno protoporfirina IX (PpIX; por ejemplo, ácido aminolaevulínico o su derivado metilo metilaminolevulinato) y una mayor irradiación de la muestra con luz roja para inducir la formación in situ de ROS a partir de oxígeno molecular intracelular (Figura 1). Este procedimiento fotodinámico puede ser utilizado eficientemente para estimular nichos de células madre residentes, activando así los programas regenerativos del tejido^19,20 y abriendo el camino a nuevas modalidades terapéuticas en medicina regenerativa de la piel. Aquí, presentamos una descripción detallada del protocolo, mostrando ejemplos representativos de estimulación de nichos de células madre, medida como un aumento en el número de células retenedoras de la etiqueta 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) a largo plazo (LRC) en la región abultada del folículo piloso^19,21, y la posterior activación de programas de regeneración (aceleración del crecimiento del cabello y procesos de cicatrización de quemaduras) inducidos por procesos transitorios^, Producción de ROS no letales en la piel de la cepa de ratón C57Bl6.

Protocol

Todos los procedimientos de cría y experimentación de ratones deben llevarse a cabo de conformidad con la legislación local, nacional e internacional y las directrices sobre experimentación animal. 1. Inducción del crecimiento del cabello, inducción de quemaduras e identificación de LRC BrdU a largo plazo en el epitelio de la piel de la cola NOTA: Utilice ratones C57BL/6 de 10 o 7 semanas de edad, preferiblemente compañeros de camada, para los diseños experim…

Representative Results

La administración tópica del precursor mALA en la piel de la espalda y la cola del ratón da lugar a una acumulación significativa de PpIX en todo el tejido y, notablemente, en el folículo piloso, como lo demuestra la fluorescencia de color rosa rojizo de este compuesto bajo excitación con luz azul (407 nm) (Figura 2A,C). La irradiación posterior del tejido tratado con luz roja (636 nm) a una fluencia de 2,5−4 J/cm2 promueve la producción transitoria de R…

Discussion

Aquí, presentamos una metodología que permite una activación transitoria de la producción endógena de ROS in vivo en la piel del ratón con efectos fisiológicos. La metodología se basa en un procedimiento fotodinámico para inducir una estimulación controlada y local del fotosensibilizador endógeno PpIX (Figura 1B). Este enfoque experimental es una herramienta interesante para estudiar la biología de las ROS en sistemas experimentales in vivo, constituyendo un avance significativo …

Materials

2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate	Sigma Aldrich	D6883-50MG
5'-bromo-2'-deoxiuridine	Sigma Aldrich	B5002-500MG
Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein	Roche	11202693001
Depilatory cream (e.g., Veet)	Veet
Dihydroethidium	Sigma Aldrich	37291-25MG
In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2	Perkin Elmer
mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g	Galderma
Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)	ThorLabs
Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp	Photocure ASA