微挥和荧光素-提拉美化物，用于小鼠肾上腺的多重免疫染色 – 使用来自同一宿主物种的未结合原抗体
Summary
利用来自同一宿主物种的初级抗体，已经建立了几种不同的多路免疫染色方法。在这里，我们描述了在正式固定石蜡嵌入小鼠肾上腺部分进行多倍免疫染色期间，使用微波介导的抗体剥离和荧光素-酪酰胺来阻止抗体的交叉反应。
Abstract
免疫染色在生物医学研究中广泛应用，以显示特定蛋白质的细胞表达模式。多路免疫染色允许使用多种原抗体进行标记。为了尽量减少抗体交叉反应，使用间接染色进行多路免疫染色需要来自不同宿主物种的未标记原抗体。然而，不同物种抗体的适当组合并不总是可用的。在这里，我们描述了一种使用来自同一宿主物种（例如，在本例中两种抗体来自兔子）的未标记原抗体的方法，用于在形式固定的石蜡嵌入（FFPE）小鼠肾上腺部分进行多倍免疫荧光。该方法使用抗原检索步骤中使用的相同程序和试剂来去除先前染色的原抗体复合物的活性。幻灯片使用一般免疫染色方案染色的第一个初级抗体，然后与生物浸化二级抗体结合步骤。然后，采用一种以氟磷-酪酰胺为基质的avidin-生物素-过氧化物酶信号开发方法。通过浸入微波沸腾柠酸钠溶液8分钟，剥离了第一原发抗体复合物的免疫活性。不溶性氟磷-酪酰胺沉积留在样品上，使滑道上沾染了其他主要抗体。虽然这种方法消除了大多数误报信号，但抗体交叉反应的某些背景可能仍然存在。如果样品富含内源性生物锡，则可以使用过氧化物酶结合二级抗体替代生物异化二级抗体，以避免从回收的内源性生物锡中误化的假阳性。
Introduction
在多路免疫染色中，使用结合原抗体直接染色可提供信息性结果。不使用二级抗体，直接染色方法具有来自抗体交叉反应的虚假共定位信号的低风险。然而，在原抗体上的偶联记者（荧光、酶）或生物锡限制了其未来用途。或者，间接免疫染色通常通过使用未结合的初级抗体与标记的次级抗体提供更强的信号。理想情况下，用于多倍免疫染色的未结合原抗体应来自不同宿主物种，以避免抗体交叉反应。然而，不同宿主物种的初级抗体的适当组合并不总是可用的。
已经建立了几种方法来消除二级抗体与不需要的初级抗体反应的风险。一种常见的方法是使用F（ab）单体抗体在第二原抗体1染色之前，阻断第一原抗体复合物上任何剩余的结合表位。抗体剥离，这是类似于条带和重新探针的西方斑点片，去除以前染色的抗体复合物，而不剥离可检测的检测报告分子的沉积，如3，3′-二氨基苯甲二甲酸酯四氯化物（DAB）2和荧光酪酰胺沉积3。使用这种方法，不同颜色的记者从分子可以在同一张幻灯片上显示多路复用结果。通过完全去除先前沉积的抗体层，以及从其他抗体4、5中对齐随后获得的图像，也可以实现多重染色。这些方法都提供了可靠的结果，尽管每种方法都有其局限性，并且需要复杂的过程或特殊的成像系统。
本协议显示了使用常用缓冲液的抗体剥离方法的应用。该协议可用于对正式固定石蜡嵌入 （FFPE） 小鼠肾上腺部分执行多倍免疫荧光染色，同时使用来自同一宿主物种的两种未标记的主要抗体。
Protocol
Representative Results
Discussion
多路免疫染色可用于检查两种或两种以上抗原的细胞共定位。当初级抗体与不同的检测器（直接染色）结合时，这种广泛使用的技术提供了令人信服的共定位结果。然而，与间接染色相比，直接染色通常提供较弱的信号，这涉及结合的二级抗体来检测初级抗体。在间接染色中，高质量的多路免疫染色结果取决于二级抗体能否区分不同的原抗体。由于可能的抗体交叉反应，使用间接染色方法的多重?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由NIH R00 HD032636支持。
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
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