Microwaving en Fluorophore-Tyramide voor Multiplex Immunostaining op Muis bijnieren − Met behulp van ongeconjugeerde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten
Summary
Er zijn verschillende methoden vastgesteld voor multiplex immunostaining met primaire antilichamen van dezelfde gastheersoort. Hier beschrijven we het gebruik van microgolf-gemedieerde antilichaam strippen en van fluorophore-tyramide om antilichaam cross-reactiviteit te blokkeren tijdens multiplex immunostaining op formaline-vaste paraffine-embedded muis bijnier secties.
Abstract
Immunostaining wordt veel gebruikt in biomedisch onderzoek om het cellulaire expressiepatroon van een bepaald eiwit aan te tonen. Multiplex immunostaining maakt etikettering met behulp van meerdere primaire antilichamen mogelijk. Om cross-reactiviteit van antilichamen te minimaliseren, vereist multiplex immunostaining met indirecte kleuring niet-gelabelde primaire antilichamen van verschillende gastheersoorten. De juiste combinatie van verschillende soortenantilichamen is echter niet altijd beschikbaar. Hier beschrijven we een methode voor het gebruik van niet-gelabelde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten (bijvoorbeeld, in dit geval zijn beide antilichamen van konijn) voor multiplex immunofluorescentie op formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) muis bijniersecties. Deze methode maakt gebruik van dezelfde procedure en reagentia die in de antigeenterugwinningsstap worden gebruikt om de activiteit van het eerder gekleurde primaire antilichaamcomplex te ontdoen. Dia’s werden gekleurd met het eerste primaire antilichaam met behulp van een algemeen immunostaining protocol gevolgd door een bindende stap met een biotinylated secundair antilichaam. Vervolgens werd een avidin-biotine-peroxidase signaal ontwikkelingsmethode gebruikt met fluorophore-tyramide als substraat. De immunoactiviteit van het eerste primaire antilichaamcomplex werd gestript door onderdompeling in een microgolfkokende natriumcitraatoplossing voor 8 min. De onoplosbare fluorophore-tyramideafzetting bleef op het monster staan, waardoor de dia kon worden vastgehouden met andere primaire antilichamen. Hoewel deze methode elimineert de meeste vals-positieve signalen, sommige achtergrond van antilichaam cross-reactiviteit kan blijven. Als de monsters zijn verrijkt met endogene biotine, kan een geperoxideerd secundair antilichaam worden gebruikt ter vervanging van het biogetinylated secundair einlichaam om het vals-positieve van teruggewonnen endogene biotine te voorkomen.
Introduction
In multiplex immunostaining, directe vlekken met behulp van geconjugeerde primaire antilichamen kan informatieve resultaten opleveren. Zonder gebruik te maken van secundaire antilichamen, de directe kleuring methode heeft een laag risico van valse colokalisatie signalen van antilichaam cross-reactiviteit. Echter, de geconjugeerde verslaggevers (fluorophore, enzymen) of biotine op het primaire antilichaam beperken het toekomstige gebruik ervan. Als alternatief geeft indirecte immunovlekken meestal sterkere signalen met behulp van een ongeconjugeerd primair antilichaam met een gelabeld secundair antilichaam. Idealiter moeten ongeconjugeerde primaire antilichamen die worden gebruikt in multiplex immunostaining afkomstig zijn van verschillende gastheersoorten om cross-reactiviteit van antilichamen te voorkomen. De juiste combinatie van primaire antilichamen van verschillende gastheersoorten is echter niet altijd beschikbaar.
Er zijn verschillende methoden vastgesteld om het risico te elimineren dat het secundaire antilichaam reageert met een ongewenst primair antilichaam. Een veel voorkomende methode is het gebruik van een F(ab) monomeric antilichaam om eventuele resterende bindende epitopen op het eerste primaire antilichaamcomplex te blokkeren voordat het wordt bevlekken met het tweede primaire antilichaam1. Antilichaam strippen, die vergelijkbaar is met de strip en reprobe van een westerse vlek blad, verwijdert de eerder gekleurde antilichaam complex zonder strippen van de afzetting van detecteerbare reporter moleculen zoals 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)2 en de fluorescerende tyramide afzetting3. Met deze methode kunnen reportermoleculen in verschillende kleuren een multiplexresultaat op dezelfde dia weergeven. De multiplex kleuring is ook haalbaar door de volledige verwijdering van de eerder gedeponeerde lagen antilichamen en de uitlijning van vervolgens verworven beelden van andere antilichamen4,5. Deze methoden geven allemaal betrouwbare resultaten, hoewel elke methode zijn beperkingen heeft en ingewikkelde procedures of een speciaal beeldvormingssysteem vereist.
Het huidige protocol toont de toepassing van een antilichaam strippen methode met het gebruik van algemeen beschikbare buffers. Dit protocol kan worden gebruikt voor het uitvoeren van multiplex immunofluorescente vlekken op formaline-fixed paraffine-embedded (FFPE) muis bijniersecties met twee niet-gelabelde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Multiplex immunostaining is nuttig om de cellulaire colokalisatie van twee of meer antigenen te onderzoeken. Deze veel gebruikte techniek geeft overtuigende colokalisatie resultaten wanneer primaire antilichamen worden geconjugeerd met verschillende verslaggevers (directe kleuring). Echter, directe kleuring biedt meestal zwakkere signalen in vergelijking met indirecte vlekken, waarbij geconjugeerde secundaire antilichamen om de primaire antilichamen te detecteren. Bij indirecte kleuring is een hoogwaardig multiplex immun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door NIH R00 HD032636.
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
