마우스 부신에 멀티플렉스 면역 염색을 위한 마이크로 웨이브 및 플루오로포어 티라미드 - 동일한 숙주 종에서 분리되지 않은 1 차 항체를 사용하여
Summary
동일한 숙주 종으로부터의 1차 항체를 사용하여 멀티플렉스 면역염색을 위해 여러 가지 다른 방법이 확립되었다. 여기서, 우리는 포르말린 고정 파라핀 내장 마우스 부신 절편에서 멀티플렉스 면역 염색 동안 항체 교차 반응성을 차단하기 위해 마이크로파 매개 항체 스트리핑 및 플루오로포폴-티라미드의 사용을 설명한다.
Abstract
면역 염색은 주어진 단백질의 세포 발현 패턴을 보여주기 위해 생물 의학 연구에서 널리 사용된다. 멀티플렉스 면역 염색은 다중 1 차적인 항체를 사용하여 표지를 허용합니다. 항체 교차 반응성을 최소화하기 위해, 간접 염색을 이용한 멀티플렉스 면역 염색은 다른 숙주 종으로부터의 표지되지 않은 1차 항체를 필요로 한다. 그러나, 상이한 종 항체의 적절한 조합이 항상 이용 가능한 것은 아니다. 여기서, 우리는 포르말린 고정 파라핀-임베디드(FFPE) 마우스 부신 절편상에 대한 다중 면역형광에 대해 동일한 숙주 종(예를 들어, 두 항체가 토끼로부터)으로부터 표지되지 않은 1차 항체를 사용하는 방법을 설명한다. 이 방법은 항원 회수 단계에서 사용되는 동일한 절차 및 시약을 사용하여 이전에 염색된 1차 항체 복합체의 활성을 제거한다. 슬라이드는 일반적인 면역 염색 프로토콜을 사용하여 제1 차 항체로 염색하고 생체면역이차 항체를 이용한 결합 단계를 따랐다. 이어서, 아비딘-비오틴-과산화증 신호 개발 방법을 기질로서 불소-티라미드와 함께 사용하였다. 제1 차 항체 복합체의 면역활성을 전자레인지에 침지하여 8분 동안 구연산나트륨 용액을 제거하였다. 불용성 형광부-티라미드 증착은 샘플에 남아 있었고, 이는 슬라이드가 다른 1차 항체로 염색될 수 있게 하였다. 이 방법은 대부분의 거짓 양성 신호를 제거하지만, 항체 교차 반응성에서 일부 배경은 남아있을 수 있습니다. 시료가 내인성 비오틴으로 농축되는 경우, 과산화공소 이차 항체는 회수된 내인성 비오틴으로부터 거짓 양성을 피하기 위해 생체연화된 이차 항체를 대체하는데 사용될 수 있다.
Introduction
멀티플렉스 면역 염색에서, 공액 된 1 차 항체를 사용하여 직접 염색은 유익한 결과를 제공 할 수 있습니다. 이차 항체를 사용하지 않고, 직접 염색 방법은 항체 교차 반응성으로부터거짓 동경화 신호의 위험이 낮다. 그러나, 1차 항체상에 공액된 리포터(플루오로폴레, 효소) 또는 비오틴은 향후 사용을 제한한다. 대안적으로, 간접 면역 염색은 일반적으로 표지된 이차 항체를 가진 비공액 1차 항체를 사용하여 더 강한 신호를 제공한다. 이상적으로, 멀티플렉스 면역염색에 사용되는 비conjugated 1 차 항체는 항체 교차 반응성을 피하기 위해 상이한 숙주 종으로부터 와야 한다. 그러나, 상이한 숙주 종으로부터의 1차 항체의 적절한 조합이 항상 이용 가능한 것은 아니다.
바람직하지 않은 1차 항체와 반응하는 이차 항체의 위험을 제거하기 위해 여러 가지 방법이 확립되었다. 한 가지 일반적인 방법은 제1 차 항체 1로 염색하기 전에 제1 차 항체 복합체에 대한 잔존 결합 에피토프를 차단하는 F(ab) 단일성 항체를 사용하는것이다. 서양 블롯 시트의 스트립 및 재프로브와 유사한 항체 스트리핑은 3,3′-다미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(DAB)2 및 형광 티라미드 증착3와같은 검출 가능한 리포터 분자의 증착을 제거하지 않고 이전에 염색된 항체 복합체를 제거한다. 이 방법을 사용하면 서로 다른 색상의 리포터 분자가 동일한 슬라이드에서 멀티플렉스 결과를 표시할 수 있습니다. 멀티플렉스 염색은 또한 이전에 증착된 항체층을 완전히 제거하고 다른 항체로부터 이후에 획득된 이미지의정렬에의해 달성된다4,5. 각 방법에는 한계가 있고 복잡한 절차 또는 특별한 이미징 시스템이 필요하지만 이러한 방법은 모두 신뢰할 수있는 결과를 제공합니다.
본 프로토콜은 일반적으로 이용 가능한 완충제의 사용과 함께 항체 스트리핑 방법의 적용을 나타낸다. 이 프로토콜은 동일한 숙주 종으로부터 2개의 표지되지 않은 1차 항체를 가진 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) 마우스 부신 절편에서 다중 면역형광 염색을 수행하는데 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
멀티플렉스 면역염색은 2개 이상의 항원들의 세포 동국화를 검사하는데 유용하다. 이 널리 사용되는 기술은 1 차 항체가 다른 기자 (직접 염색)와 공액 될 때 설득력있는 동국화 결과를 제공합니다. 그러나, 직접 염색은 일반적으로 1 차적인 항체를 검출하기 위하여 공액한 이차 항체를 관련시키는 간접 염색에 비교된 더 약한 신호를 제공합니다. 간접 염색에서, 고품질 멀티플렉스 면역염색 결과?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH R00 HD032636에 의해 지원됩니다.
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
References
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
- Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
- Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
- Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
- Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
- Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).
