Microwaving y fluorofore-Tyramida para inmunomanchado multiplex en las adrenales del ratón - Uso de anticuerpos primarios no conjugados de la misma especie anfitriona
Summary
Se han establecido varios métodos diferentes para la inmunomanchación múltiple utilizando anticuerpos primarios de la misma especie huésped. Aquí, describimos el uso de desmontaje de anticuerpos mediados por microondas y de taquimida de fluoróforo para bloquear la reactividad cruzada de anticuerpos durante la inmunomancha multiplex en secciones suprarrenales de ratón incrustadas en parafina fija sin forfina.
Abstract
La inmunomancha es ampliamente utilizada en la investigación biomédica para mostrar el patrón de expresión celular de una proteína dada. La inmunomancha múltiple permite el etiquetado con múltiples anticuerpos primarios. Para minimizar la reactividad cruzada de anticuerpos, la inmunomancha múltiple mediante tinción indirecta requiere anticuerpos primarios sin etiquetar de diferentes especies huésped. Sin embargo, la combinación adecuada de diferentes especies de anticuerpos no siempre está disponible. Aquí, describimos un método de uso de anticuerpos primarios sin etiquetar de la misma especie huésped (por ejemplo, en este caso, ambos anticuerpos son de conejo) para la inmunofluorescencia múltiplex en secciones suprarrenales de ratón con incrustación de parafina fijada en formalina (FFPE). Este método utiliza el mismo procedimiento y reactivos utilizados en el paso de recuperación de antígenos para eliminar la actividad del complejo de anticuerpos primarios previamente manchado. Las diapositivas se teñieron con el primer anticuerpo primario utilizando un protocolo general de inmunomanchado seguido de un paso de unión con un anticuerpo secundario biotinilado. Luego, se utilizó un método de desarrollo de señal de avidina-biotina-peroxidasa con fluoróforo-tiramida como sustrato. La inmunoactividad del primer complejo de anticuerpos primarios se desprendía a través de la inmersión en una solución de citrato de sodio hirviendo por microondas durante 8 min. La deposición insoluble de fluoróforo-tiramida permaneció en la muestra, lo que permitió que la diapositiva se manchase con otros anticuerpos primarios. Aunque este método elimina la mayoría de las señales falsas positivas, puede quedar algún fondo de la reactividad cruzada de anticuerpos. Si las muestras se enriquecen con biotina endógena, se puede utilizar un anticuerpo secundario conjugado por peroxidasa para reemplazar el anticuerpo secundario biotintilado para evitar el falso positivo de la biotina endógena recuperada.
Introduction
En la inmunomancha múltiple, la tinción directa con anticuerpos primarios conjugados puede proporcionar resultados informativos. Sin el uso de anticuerpos secundarios, el método de tinción directa tiene un bajo riesgo de señales de colocalización falsas debido a la reactividad cruzada de anticuerpos. Sin embargo, los reporteros conjugados (fluoróforo, enzimas) o biotina en el anticuerpo primario limitan su uso futuro. Alternativamente, la inmunomancha indirecta generalmente proporciona señales más fuertes mediante el uso de un anticuerpo primario no conjugado con un anticuerpo secundario etiquetado. Idealmente, los anticuerpos primarios no conjugados utilizados en la inmunomancha múltiple deben provenir de diferentes especies anfitrionas para evitar la reactividad cruzada de anticuerpos. Sin embargo, la combinación adecuada de anticuerpos primarios de diferentes especies anfitrionas no siempre está disponible.
Se han establecido varios métodos para eliminar el riesgo de que el anticuerpo secundario reaccione con un anticuerpo primario no deseado. Un método común es el uso de un anticuerpo monomérico F(ab) para bloquear los epítopos de unión restantes en el primer complejo de anticuerpos primarios antes de manchar con el segundo anticuerpo primario1. El desmontaje de anticuerpos, que es similar a la tira y resondas de una hoja de manchas occidentales, elimina el complejo de anticuerpos previamente teñidos sin eliminar la deposición de moléculas de reportero detectables como el tetrahidrocloruro de 3,3′-diaminobenzidina (DAB)2 y la deposición de tiramida fluorescente3. Con este método, las moléculas de reportero en diferentes colores pueden mostrar un resultado multiplex en la misma diapositiva. La tinción múltiple también se puede lograr mediante la eliminación completa de las capas de anticuerpos previamente depositadas y la alineación de las imágenes adquiridas posteriormente de otros anticuerpos4,5. Todos estos métodos proporcionan resultados fiables, aunque cada método tiene sus limitaciones y requiere procedimientos complicados o un sistema de imágenes especial.
El presente protocolo muestra la aplicación de un método de desmontaje de anticuerpos con el uso de búferes comúnmente disponibles. Este protocolo se puede utilizar para realizar la tinción inmunofluorescente múltiple x en secciones suprarrenales de ratón con incrustación de parafina fija de formalina (FFPE) con dos anticuerpos primarios sin etiquetar de la misma especie huésped.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inmunomancha múltiple es útil para examinar la colocalización celular de dos o más antígenos. Esta técnica ampliamente utilizada da resultados convincentes de colocación cuando los anticuerpos primarios se conjugan con diferentes reporteros (tinción directa). Sin embargo, la tinción directa generalmente proporciona señales más débiles en comparación con la tinción indirecta, que implica anticuerpos secundarios conjugados para detectar los anticuerpos primarios. En la tinción indirecta, un resultado de i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es compatible con NIH R00 HD032636.
Materials
| Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Biotinylated donkey anti-mouse | JacksonImmuno | 715-066-151 | 1:500 dilution |
| Biotinylated donkey anti-rabbit | JacksonImmuno | 711-066-152 | 1:500 dilution |
| DAPI | BioLegend | 422801 | 2 μg/mL in distilled water |
| Fluorescence microscope | ECHO | Revolve 4 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin | JacksonImmuno | 016-030-084 | 1:1000 dilution |
| Microwave oven, 700W | General Electric | JEM3072DH1BB | |
| Mouse anti-CYP2F2 | Santa Cruz, | SC-374540 | 1:250 dilution |
| Mouse anti-TH | Santa Cruz, | SC-25269 | 1:1000 dilution |
| Normal donkey serum | JacksonImmuno | 017-000-121 | 2% serum in PBST |
| Rabbit anti-20αHSD | Kerafast, | EB4002 | 1:500 dilution |
| Rabbit anti-3βHSD | TransGenic, | KO607 | 1:250 dilution |
| Rabbit anti-TH | NOVUS, | NB300-109 | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-β-catenin | Abcam, | ab32572 | 1:500 dilution |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP) | JacksonImmuno | 016-303-084 | 1:1000 dilution |
| TSA Cy3 Tyramide | PerkinElmer | SAT704B001EA | 1:100 dilution |
| TSA Fluorescein Tyramide | PerkinElmer | SAT701001EA | 1:100 dilution |
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