Opsono-Adherence Test pour évaluer les anticorps fonctionnels dans le développement de vaccins contre les anthracis Bacillus et autres pathogènes encapsulés
Summary
L’essai d’opsono-adhérence est une méthode alternative à l’essai opsono-phagocytic de tuer pour évaluer les fonctions opsonic des anticorps dans le développement de vaccin.
Abstract
L’essai d’opsono-adhérence est un essai fonctionnel qui énumère l’attachement des pathogènes bactériens aux phagocytes professionnels. Puisque l’adhérence est nécessaire à la phagocytose et à la mise à mort, l’essai est une méthode alternative aux analyses opsono-phagocytiques de mise à mort. Un avantage de l’essai d’opsono-adhérence est l’option d’utiliser des agents pathogènes inactivés et des lignées cellulaires de mammifères, qui permet la normalisation à travers plusieurs expériences. L’utilisation d’un agent pathogène inactivé dans l’analyse facilite également le travail avec des agents infectieux de niveau 3 de biosécurité et d’autres agents pathogènes virulents. Dans nos travaux, l’essai d’opsono-adhérence a été employé pour évaluer la capacité fonctionnelle des anticorps, du sera des animaux vaccinés avec un vaccin à base de capsule d’anthrax, pour induire l’adhérence des anthracis fixes de Bacillus à une lignée cellulaire de macrophage de souris, RAW 264.7. La microscopie automatisée de fluorescence a été employée pour capturer des images des bacilles adhérant aux macrophages. L’adhérence accrue a été corrélée avec la présence des anticorps d’anti-capsule dans le sérum. Les primates non humains qui présentaient des concentrations élevées d’anticorps anti-capsules sériques ont été protégés contre le défi de l’anthrax. Ainsi, l’essai d’opsono-observance peut être employé pour élucider les fonctions biologiques des anticorps spécifiques d’antigène dans sera, pour évaluer l’efficacité des candidats de vaccin et d’autres thérapeutiques, et pour servir de corrélation possible de l’immunité.
Introduction
La reconnaissance, l’adhérence, l’internalisation et la dégradation d’un agent pathogène font partie intégrante de la phagocytose1, une voie saillante dans la réponse immunitaire innée de l’hôte décrite pour la première fois par Ilya Metchnikoff en 18832,3. Les leucocytes phagocytiques, ainsi que d’autres cellules du système immunitaire, sont très discriminatoires dans leur sélection des cibles; ils sont capables de faire la distinction entre le « non-soi infectieux » et le « soi non infectieux » par des modèles moléculaires associés à l’agent pathogène par leur répertoire de récepteurs de reconnaissance des motifs (PRR)4,5. La reconnaissance par l’hôte d’un agent pathogène peut également se produire avec la liaison des opsonines hôtes, comme le complément et lesanticorps 6. Ce processus, appelé opsonisation, enrobe l’agent pathogène de ces molécules, améliorant l’internalisation en se liant aux récepteurs opsoniques (p. ex., récepteurs de complément et de Fc) sur les cellules phagocytiques6. Pour qu’un agent pathogène adhère à un phagocyte, la liaison collective de récepteurs multiples avec leurs ligands cognate est nécessaire. Ce n’est qu’alors que l’adhérence peut déclencher et soutenir des cascades de signalisation à l’intérieur de la cellule hôte pour initier l’internalisation6.
En raison de l’importance de la phagocytose dans le dégagement des agents pathogènes et la prévention de l’infection, les agents pathogènes extracellulaires ont développé de nombreuses façons de subvertir ce processus pour prolonger leur survie. Une stratégie d’importance est la production d’une capsule anionique polymérique (p. ex., polysaccharide ou acide polyamino) qui est anti-phagocytique en raison de sa charge, est mal immunogène, et protège les molécules sur l’enveloppe bactérienne des PRR6,7. Des agents pathogènes tels que cryptococcus néoformans et streptocoques pneumoniae ont des capsules composées de polymères saccharides, tandis que Staphylococcus epidermidis et certaines espèces de Bacillus produisent de l’acide poly-ɣ-glutamique (PGGA)7,8. Pourtant, d’autres agents pathogènes produisent des capsules qui ressemblent à l’auto non infectieuse. Par exemple, Streptococcus pyogenes et une souche pathogène de B. cereus ont une capsule d’acide hyaluronique qui est non seulement anti-phagocytique, mais qui peut également ne pas être reconnu comme étranger par le système immunitaire9,10.
La conjugaison de la capsule en protéines porteuse les convertit à partir d’antigènes pauvres et indépendants en T hautement immunogènes dépendants des antigènes qui peuvent induire des titres anticorps anti-capsule sériquesélevés 11,12. Cette stratégie est utilisée pour les vaccins homologués contre S. pneumoniae, Haemophilus influenzaeet Neisseria meningitides11. Les activités opsoniques des anticorps anti-capsules ont généralement été évaluées par des analyses de mise à mort opsono-phagocytiques (OPKA)13,14,15,16. Ces analyses testent si les anticorps fonctionnels peuvent déclencher la phagocytose et tuer14. Toutefois, l’utilisation de l’OPKA avec des agents pathogènes infectieux, tels que les agents et toxines biologiques de niveau 1 (BSAT), y compris B. anthracis17,est dangereuse et présente des risques pour la sécurité; ces analyses nécessitent une manipulation approfondie d’un agent sélectionné. La manipulation d’agents sélectionnés ne peut se faire que dans des laboratoires restreints de niveau 3 (BSL-3); les travaux dans ces domaines exigent des procédures d’exploitation prolongées en raison des nombreuses précautions de sécurité qui doivent être suivies. Les laboratoires BSL-3 ne sont généralement pas équipés de l’équipement spécialisé utilisé pour le travail opka, comme les microscopes et les cytomètres. Ainsi, nous avons développé un essai alternatif basé sur l’utilisation de bactéries inactivées18,19. Nous appelons cela un essai opsono-adhérence (OAA) qui ne dépend pas de l’internalisation et de tuer comme sorties d’analyse; au lieu de cela, l’adhérence des agents pathogènes inactivés opsonized est employée comme index de phagocytosis. Mécaniquement, oaa est un substitut approprié parce que l’adhérence se produit a priori et est intimement liée à l’internalisation et à la mise à mort intracellulaire. Du point de vue de la biosécurité, l’OAA est préférable parce qu’elle nécessite une manipulation minimale d’un agent infectieux, est expérimentalement de plus courte durée que l’OPKA et peut être effectuée dans les laboratoires BSL-2 après qu’un stock de l’agent pathogène inactivé a été produit et transféré.
Nous démontrons l’utilisation de l’OAA pour examiner la fonction opsonique des anticorps anti-capsules trouvés dans sera des primates non humains (NHPs) vaccinés avec une capsule conjuguée [c.-à-PGGA de B. anthracis conjugué au complexe de protéine de membrane externe (OMPC) des méningitides de Neisseria]20. Des bacilles opsonized de sérum ont été incubés avec une ligne adhérente de cellules de macrophage de souris, RAW 264.7. Après fixation, le monocouche cellulaire et les bacilles adhérents ont été photographiés par microscopie de fluorescence. L’adhérence bactérienne a augmenté quand les bacilles ont été incubés avec le sérum des NHPs vaccinés avec le conjugué de capsule comparé au sérumde contrôle 20. L’adhérence est corrélée avec la survie du défi anthrax20,21. Ainsi, l’utilisation de l’OAA a caractérisé la fonction des anticorps anti-capsule et a grandement facilité l’essai de notre candidat de vaccin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les vaccins à base de capsules se sont montrés efficaces contre de nombreux agents pathogènes bactériens, et beaucoup sont homologués pour uneutilisation chez l’homme 25,26,27. Ces vaccins fonctionnent en générant des anticorps ciblant la capsule et beaucoup de ces études utilisent l’OPKA pour montrer les fonctions opsono-phagocytiques des anticorps13,14…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J. Chua, D. Chabot et A. Friedlander ont conçu les procédures décrites dans le manuscrit. J. Chua et T. Putmon-Taylor ont effectué les expériences. D. Chabot a effectué une analyse des données. J. Chua a écrit le manuscrit.
Les auteurs remercient Kyle J. Fitts pour son excellente assistance technique.
Le travail a été soutenu par la subvention de l’Agence de réduction des menaces de défense CBM. VAXBT.03.10.RD.015, numéro de plan 921175.
Les opinions, interprétations, conclusions et recommandations sont celles des auteurs et ne sont pas nécessairement approuvées par l’armée américaine. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les points de vue ou les politiques du département de la Défense, et la mention de noms commerciaux, de produits commerciaux ou d’organisations n’implique pas nécessairement l’approbation du gouvernement des États-Unis.
Materials
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
References
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144 (1883).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
- Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
- Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
- Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
- Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
- Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
- Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
- Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
- Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
- Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
- Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
- Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
- Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
- Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
- Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
- Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
- . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition) Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011)
- Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, 1-9 (2013).
- Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
- Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
- Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
- Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400 (2019).
- Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250 (1999).
- Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
- Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
- Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
- Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
- Wolf, J. J. . Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , 243-255 (2013).
