ضخ جنبا إلى جنب والتحفيز مع المسح السريع قياس فولتامتري الحلقي (CIS-FSCV) لتقييم تنظيم مستقبلات منطقة تيغمنتال البطنية من الدوبامين التدريجي
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو التعامل مباشرة مستقبلات منطقة tegmental البطني لدراسة مساهمتها في إطلاق الدوبامين تحت الثانوي.
Abstract
الدوبامين التدريجي (DA) الافراج عن منطقة البطنية (VTA) إلى نواة accumbens يلعب دورا محوريا في معالجة المكافأة وتعزيز التعلم. فهم كيف يمكن للمدخلات العصبية المتنوعة في VTA التحكم phasic الافراج عن DA توفير صورة أفضل للدوائر التي تتحكم في معالجة مكافأة وتعزيز التعلم. هنا، ونحن نصف الطريقة التي تجمع بين ضخ القنية داخل VTA من ناهضات الدوائية والخصوم مع التحفيز أثار الافراج عن DA التدريجي (ضخ المشتركة والتحفيز، أو CIS) كما تقاس في الجسم الحي سريع المسح الضوئي قياس فولتامتري دوري (FSCV). باستخدام CIS-FSCV في الفئران المخدرة ، يمكن استحضار استجابة DA التدريجية عن طريق تحفيز VTA كهربائيا مع قطب ثنائي القطب مزود بعلب أثناء التسجيل في نواة accumbens الأساسية. يمكن غرس ناهضات أو مضادات دوائية مباشرة في موقع التحفيز للتحقيق في أدوار مستقبلات VTA محددة في قيادة إطلاق DA التدريجي. فائدة رئيسية من CIS-FSCV هو أن وظيفة مستقبلات VTA يمكن دراستها في الجسم الحي، بناء على الدراسات المختبرية.
Introduction
الدوبامين التدريجي (DA) الإفراج من منطقة tegmental البطني (VTA) إلى نواة accumbens (NAc) يلعب دورا حيويا في السلوكيات المتعلقة بالمكافأة. VTA DA الخلايا العصبية التحول من إطلاق النار منشط مثل (3-8 هرتز) لاطلاق النار انفجار مثل (>14 هرتز)1، والتي تنتج الافراج عن DA phasic في NAc. وVTA يعبر عن مجموعة متنوعة من مستقبلات somatodendritic التي هي في وضع جيد للسيطرة على التحول من منشط لانفجار اطلاق النار2,3,4,5. تحديد أي من هذه المستقبلات، ومدخلات كل منها، والسيطرة على الافراج عن DA phasic تعميق فهمنا لكيفية تنظيم الدوائر ذات الصلة مكافأة. الغرض من المنهجية الموصوفة هنا ، والجمع بين التسريب والتحفيز مع قياس فولتامتري دوري سريع المسح الضوئي (CIS-FSCV) ، هو تقييم سريع وقوي لوظائف مستقبلات VTA في قيادة إطلاق DA التدريجي.
مصطلح ضخ المشتركة والتحفيز (رابطة الدول المستقلة) يشير إلى التلاعب الدوائي المستقبلات على مجموعة من الخلايا العصبية (هنا VTA) وتحفيز تلك الخلايا العصبية لدراسة وظيفة المستقبلات. في الفئران المخدرة، ونحن تحفيز كهربائيا VTA لاستحضار إشارة DA تدريجي كبير (1-2 ميكرومتر) في النواة NAc، كما تقاس بسرعة المسح الضوئي قياس فولتامتري دوري (FSCV). يمكن استخدام ضخ الأدوية الدوائية (أي ناهضات المستقبلات / الخصوم) في موقع التحفيز لقياس وظيفة مستقبلات VTA من خلال مراقبة التغيير اللاحق في إطلاق DA المرحلي. FSCV هو نهج الكهروكيميائية التي تتمتع كل من المكانية العالية (50-100 ميكرومتر) والزمنية (10 هرتز) القرار، ومناسبة تماما لقياس مكافأة ذات الصلة، والأحداث DA phasic6،7. هذا القرار هو أدق من غيرها في القياسات الكيميائية العصبية في الجسم الحي، مثل غسيل الكلى الدقيق. وهكذا, معا, CIS-FSCV هو مناسبة تماما لتقييم VTA مستقبلات تنظيم إطلاق الدوبامين phasic.
طريقة واحدة شائعة للتحقيق في وظيفة مستقبلات VTA باستخدام مزيج من النهج الكهربية التي تعالج كيف تغير تلك المستقبلات معدل إطلاق الخلايا العصبية1،8. هذه الدراسات هي قيمة للغاية في فهم ما هي المستقبلات التي تشارك في قيادة DA اطلاق النار عند التنشيط. ومع ذلك، يمكن أن تشير هذه الدراسات فقط إلى ما يمكن أن يحدث في المصب في محطة المحور (أي إطلاق ناقل عصبي). CIS-FSCV يبني على هذه الدراسات الكهربية من خلال الإجابة على كيفية إخراج VTA انفجار إطلاق النار، والإفراج عن DA phasic، وينظم من قبل المستقبلات الموجودة على dendrites VTA وأجسام الخلايا. وهكذا، فإن CIS-FSCV مناسبة تماما للبناء على دراسات الفيزيولوجيا الكهربية هذه. على سبيل المثال، يمكن تنشيط مستقبلات النيكوتينية تحفز انفجار إطلاق النار في VTA9، و CIS-FSCV في الفئران تخدير استخدمت لإظهار أن مستقبلات أستيل النيكوتين (nAChR) التنشيط في VTA تسيطر أيضا على الافراج عن DA phasic في NAc10،11.
كما يدرس الفحص الميكانيكي لتنظيم DA التدريجي عادة باستخدام مستحضرات الشرائح جنبا إلى جنب مع تطبيق حمام من الأدوية. هذه الدراسات غالبا ما تركز على تنظيم presynaptic للافراج عن DA phasic من محطات الدوبامين, كما غالبا ما تتم إزالة أجسام الخلايا منشريحة 12. هذه الاستعدادات هي قيمة لدراسة آثار مستقبلات presynaptic على محطات الدوبامين, في حين CIS-FSCV هو أكثر ملاءمة لدراسة آثار مستقبلات سوماتوديندريتيك على الخلايا العصبية الدوبامين, فضلا عن المدخلات presynaptic إلى VTA. هذا التمييز مهم, لأن تنشيط مستقبلات سوماتوديندريتيك في VTA قد يكون لها تأثير مختلف عن تنشيط مستقبلات NAc presynaptic. في الواقع, منع الدوبامين nAChRs presynaptic في NAc يمكن رفع إطلاق الدوبامين phasic خلال انفجار اطلاقالنار 13, في حين أن العكس هو الصحيح في VTA somatodendritc nAChRs10,11.
CIS-FSCV هو نهج مثالي لدراسة قدرة مستقبلات VTA على تنظيم إطلاق DA التدريجي. الأهم من ذلك، يمكن تنفيذ هذا النهج في الفئران سليمة، إما تخدير أو تتحرك بحرية. هذا النهج هو مناسبة للدراسات الحادة, لدراسة وظيفة مستقبلات في حالته خط الأساس10,14 فضلا عن الدراسات طويلة الأجل التي يمكن تقييم التغيرات الوظيفية في مستقبلات بعد التعرض للدواء أو التلاعب السلوكي11,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
CIS-FSCV يوفر فرصة فريدة للتحقيق في آليات مستقبلات VTA الكامنة وراء الافراج عن DA phasic. هناك خطوتان حاسمتان من أجل ضمان التسجيل الصحيح. أولا، يجب تحقيق تسجيل خط أساس مستقر، مع القليل من الانجراف في إشارة DA المثارة. ومن الطرق الهامة لزيادة احتمال إنشاء تسجيل مستقر هو التأكد من أن القطب كان لديه متس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل من قبل كلية إليزابيث تاون (R.J.W. و M.L.و L.M) ، من قبل زمالة الدراسات العليا NSF (R.J.W.) وكلية ييل للطب (N.A.).
Materials
| Electrode Filling Solution/Supplies | |||
| Micropipette | World Precision Instruments | MF286-5 (28 gauge) | |
| Potassium Acetate | Sigma | 236497-100G | |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911-25G | |
| Electrode Supplies | |||
| Carbon fiber | Thornel | T650 | |
| Electrode puller | Narishige International | PE-22 | Note: horizontal pullers can be used as well |
| Glass capillary | A-M systems | 626000 | |
| Insulated wires for electrodes | Weico Wire and Cable Incorporated | UL 1423 | Length; 10 cm; diameter,0.4mm; must get custom made; insulated material should cover 5 cm of the wire |
| Light Microscope (for viewing and cutting electrode) | Fischer Scientific | M3700 | |
| Pin | Phoenix Enterprises | HWS1646 | To be soldered onto the insuled electrode wire and reference electrode; connects to headstage |
| Putty | Alcolin | 23922-1003 | Used to place electrode on while cutting the carbon fiber |
| Scalpal Blade | World Precision Instruments | 500239 | For cutting carbon fiber to the apprpriate length |
| Silver Wire | Sigma | 327026-4G | |
| FSCV Hardware/Software | |||
| Faraday Cage | U-Line | H-3618 (36" x 24" x 42") | |
| Potentiostat | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | ||
| Stimulating electrode | PlasticsOne | MS303/2-A/SPC | when ordering, request a 22 mm cut below pedestal |
| TarHeel HDCV Software | University of North Carolina-Chapel Hill | – | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information |
| UEI breakout box | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| UEI power supply | Univ. of N. Carolina, Electronics Facility | https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/ for ordering information | |
| Stimulator Hardware | |||
| Neurolog stimulus isolator | Digitimer Ltd. | DS4 | Neurolog 800A |
| Infusion/Stimulation Supplies | |||
| Infusion Pump | New Era Syringe Pump | NE-300 | |
| Internal Cannula | PlasticsOne | C315I/SPC INTERNAL 33GA | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 80308 | |
| Tubing | PlasticsOne | C313CT/ PKG TUBING 023 X 050 PE50 | |
| Surgical Supplies | |||
| Cannula Holder | Kopf Instruments | 1776 P-1 | |
| Cotton Tip Applicators | Vitality Medical | 806 | |
| Electrode Holder | Kopf Instruments | 1770 | |
| Heating Pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Povidone Iodine | Vitality Medical | 29906-004 | |
| Screws | Stoelting | Bone Anchor Screws/Pkg.of 100 | 1.59 mm O.D., 3.2 mm long |
| Silver wire reference with AgCl | InVivo Metric | E255A | |
| Square Gauze | Vitality Medical | 441408 | |
| Stereotax | Kopf Instruments | Model 902 (Dual Arm Bar) | |
| Histological Supplies | |||
| Formulin | Sigma | 1004960700 | |
| Power supply | BK Precision | 9110 | |
| Sucrose | Sigma | 80497 | |
| Tungsten microelectrode | MicroProbes | WE30030.5A3 | |
| Drugs for infusions | |||
| ((2R)-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma Aldrich | A5282 | |
| N-methyl-D-aspartate | Sigma Aldrich | M3262 | |
| Mecamylamine hydrochloride (M9020-5mg) | Sigma Aldrich | M9020 | |
| Scopolamine hydrobromide (S0929-1g) | Sigma Aldrich | S0929 |
References
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: burst firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2877-2890 (1984).
- Lester, D. B., et al. Midbrain acetylcholine and glutamate receptors modulate accumbal dopamine release. Neuroreport. 19 (9), 991-995 (2008).
- Lodge, D. J., Grace, A. A. The laterodorsal tegmentum is essential for burst firing of ventral tegmental area dopamine neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5167-5172 (2006).
- Li, C., et al. Mu Opioid Receptor Modulation of Dopamine Neurons in the Periaqueductal Gray/Dorsal Raphe: A Role in Regulation of Pain. Neuropsychopharmacology. 41 (8), 2122-2132 (2016).
- Zhang, H. Y., et al. Expression of functional cannabinoid CB2 receptor in VTA dopamine neurons in rats. Addiction Biology. 22 (3), 752-765 (2017).
- Wickham, R. J., et al. Advances in studying phasic dopamine signaling in brain reward mechanisms. Frontiers in Bioscience. 5, 982-999 (2013).
- Wightman, R. M., et al. Monitoring of transmitter metabolites by voltammetry in cerebrospinal fluid following neural pathway stimulation. Nature. 262 (5564), 145-146 (1976).
- Grace, A. A., Bunney, B. S. The control of firing pattern in nigral dopamine neurons: single spike firing. Journal of Neuroscience. 4 (11), 2866-2876 (1984).
- Mameli-Engvall, M., et al. Hierarchical control of dopamine neuron-firing patterns by nicotinic receptors. Neuron. 50 (6), 911-921 (2006).
- Wickham, R., et al. Ventral tegmental area alpha6beta2 nicotinic acetylcholine receptors modulate phasic dopamine release in the nucleus accumbens core. Psychopharmacology. 229 (1), 73-82 (2013).
- Solecki, W., et al. Differential role of ventral tegmental area acetylcholine and N-methyl-D-aspartate receptors in cocaine-seeking. Neuropharmacology. 75, 9-18 (2013).
- John, C. E., Jones, S. R., Michael, A. C., Borland, L. M. Fast Scan Cyclic Voltammetry of Dopamine and Serotonin in Mouse Brain Slices. Electrochemical Methods for Neuroscience. , (2007).
- Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nature Neuroscience. 7 (6), 583-584 (2004).
- Espana, R. A., et al. Hypocretin 1/orexin A in the ventral tegmental area enhances dopamine responses to cocaine and promotes cocaine self-administration. Psychopharmacology. 214 (2), 415-426 (2011).
- Addy, N. A., et al. The L-type calcium channel blocker, isradipine, attenuates cue-induced cocaine-seeking by enhancing dopaminergic activity in the ventral tegmental area to nucleus accumbens pathway. Neuropsychopharmacology. 43 (12), 2361-2372 (2018).
- Hermans, A., Wightman, R. M. Conical tungsten tips as substrates for the preparation of ultramicroelectrodes. Langmuir. 22 (25), 10348-10353 (2006).
- Borland, L. M., Michael, A. C., Borland, L. M., Michael, A. C. An Introduction to Electrochemical Methods in Neuroscience. Electrochemical Methods for Neuroscience. , (2007).
- Mundroff, M. L., Wightman, R. M. Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells. Current Protocols in Neuroscience. 6 (6), 14 (2002).
- Rodeberg, N. T., et al. Hitchhiker’s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for in vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Sabeti, J., Gerhardt, G. A., Zahniser, N. R. Chloral hydrate and ethanol, but not urethane, alter the clearance of exogenous dopamine recorded by chronoamperometry in striatum of unrestrained rats. Neuroscience Letters. 343 (1), 9-12 (2003).
- Masuzawa, M., et al. Pentobarbital inhibits ketamine-induced dopamine release in the rat nucleus accumbens: a microdialysis study. Anesthesia & Analgesia. 96 (1), 148-152 (2003).
- Montague, P. R., et al. Dynamic gain control of dopamine delivery in freely moving animals. Journal of Neuroscience. 24 (7), 1754-1759 (2004).
- Keithley, R. B., et al. Higher sensitivity dopamine measurements with faster-scan cyclic voltammetry. Analytical Chemistry. 83 (9), 3563-3571 (2011).
- Jackson, B. P., Dietz, S. M., Wightman, R. M. Fast-scan cyclic voltammetry of 5-hydroxytryptamine. Analytical Chemistry. 67 (6), 1115-1120 (1995).
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Wenzel, J. M., et al. Phasic Dopamine Signals in the Nucleus Accumbens that Cause Active Avoidance Require Endocannabinoid Mobilization in the Midbrain. Current Biology. 28 (9), 1392-1404 (2018).
- Spanos, M., et al. NMDA Receptor-Dependent Cholinergic Modulation of Mesolimbic Dopamine Cell Bodies: Neurochemical and Behavioral Studies. ACS Chemical Neuroscience. 10 (3), 1497-1505 (2019).
- Cheer, J. F., et al. Cannabinoids enhance subsecond dopamine release in the nucleus accumbens of awake rats. Journal of Neuroscience. 24 (18), 4393-4400 (2004).
- Melchior, J. R., et al. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Sun, F., et al. A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice. Cell. 174 (2), 481-496 (2018).
- Robinson, D. L., et al. Monitoring rapid chemical communication in the brain. Chemical Reviews. 108 (7), 2554-2584 (2008).
- Park, J., et al. Heterogeneous extracellular dopamine regulation in the subregions of the olfactory tubercle. Journal of Neurochemistry. 142 (3), 365-377 (2017).
- Ganesana, M., Venton, B. J. Early changes in transient adenosine during cerebral ischemia and reperfusion injury. PLoS One. 13 (5), e0196932 (2018).
