動物の香り信号のサンプリングと解析
Summary
動物のコミュニケーションに使用される方法を理解するために、匂い信号のサンプリングと分析に効果的な方法論を開発しました。特に、ヘッドスペース固相微小抽出とガスクロマトグラフィー質量分析法を用いて、動物の臭気や香りマーキングの揮発性成分を解析しています。
Abstract
ヘッドスペース固相微小分抽出とガスクロマトグラフィー質量分析法を併用し、動物のコミュニケーションにどう使われるかを理解することで、臭気信号のサンプリングと分析に効果的な方法論を開発しました。この技術により、サンプル中の成分の分離と仮同定を可能にし、続いてピーク面積比を分析して、シグナル伝達に関与する可能性のある化合物を示す傾向を探すことによって、臭気分泌物の揮発性成分を半定量的に分析することができます。このアプローチの主な強みは、分析できるサンプルタイプの範囲です。複雑なサンプル調製または抽出の必要性の欠如;混合物の成分を分離し、分析する能力。検出されたコンポーネントの識別。検出されたコンポーネントに関する半定量的かつ定量的な情報を提供する能力。方法論の主な制限は、サンプル自体に関連しています。特定の関心の成分は揮発性であり、これらは容易に失われるか、またはそれらの濃度が変化する可能性があるため、サンプルを収集した後に適切に保存し、輸送することが重要です。これはまた、サンプルの保管および輸送条件が比較的コストがかかることを意味します。この方法は、様々なサンプル(尿、便、毛髪、香り-腺臭い分泌物を含む)に適用することができます。これらの臭気は、複雑な混合物からなり、マトリックスの範囲で発生し、したがって、個々の成分を分離し、生物学的関心の化合物を抽出する技術の使用を必要とする。
Introduction
動物1の嗅覚信号を支える化学的変化についてはほとんど知られていないが、また、臭気の揮発性化学プロファイルを記録および定量する方法論的な課題のために2。非常に複雑な化学マトリックスを扱う場合、いくつかの潜在的な落とし穴があります。これらには、臭いサンプル3をサンプリングして分析する際に含まれます。
ウォルヴァーハンプトン大学ロザリンド・フランクリン科学センターでは、動物がどのように使用されるのかを理解するために、臭いや香りの分析を行っています。化学と行動生態学、内分泌学、細胞診を組み合わせて、動物のコミュニケーションにおける嗅覚信号の役割の理解を深めます。
方法論を開発し、ヒト以外の霊長類(すなわち、キツネザル、赤いキツネザル、日本のマカク、オリーブヒヒ、チンパンジー)、その他の哺乳類(猫、牛など)を含む様々な種の臭気やマーキングを分析しました。尿、便、毛髪、香り臭気分など、さまざまなサンプルを収集・解析しています。これらの臭気と香りマークは、化合物の複雑な混合物で構成されているので、分析に使用される方法論は、セパレーター技術の何らかの形を含める必要があります。図示されているように、それらはまた、興味のある成分を抽出する技術の使用を必要とする行列の範囲で発生する。
Vaglioら4および他 の著者5 によるこれまでの研究では、直接溶媒抽出6 および複雑な溶媒抽出7 を用いた一方で、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)を用いた動的ヘッドスペース抽出(DHS)を用いた。特に、動的ヘッドスペースサンプリングでは、サンプルマトリックス(例えば、水性サンプル中の極性化合物)に強い親和性を示す化合物を除き、すべての揮発性化合物を最終的に除去する既知の不活性ガスの体積でヘッドスペースをパージする必要があります。
現在の方法論では、ヘッドスペース固相微小抽出(HS-SPME)とGC-MSの技術を採用しています。特に、我々は、以前のGC-MSの実験室8、9、10でVaglioらによって既に使用されている方法論を開発し、強化した。
溶媒のない抽出技術は、これらの方法が安定した固相支持体上で化合物を固定化するため、小さく、揮発性の高い化合物(サンプルから容易に失われる可能性がある)を分析するのに非常に効果的です。HS-SPMEは、吸着性ポリマーで被覆された繊維を用いて、試料ヘッドスペース内の揮発性化合物を捕捉したり、水性生物学的流体11に浸漬して溶解化合物を抽出したりする。ポリマーコーティングは化合物を強く結合しないため、よってGCの注入口で加熱することによって、それらが除去できる。この方法は、溶媒抽出技術よりも強力であり、DHSよりも効果的です。
現在のアプローチでは、サンプルはガラスバイアル内に含まれています。これらのバイアルは、バイアルのヘッドスペースを占有するために香りマークの揮発性成分を促進するために動物の体温をシミュレートするために40°Cの温度に温めます。65μmのポリジメチルシロキサン/ジビニルベンゼン(PDMS/DVB)吸着材でコーティングされたSPME繊維はヘッドスペース環境にさらされ、サンプルからの揮発性成分は繊維に吸着されます。GC-MSの入口ポートで繊維を加熱すると、揮発性成分は繊維から脱離され、次いでGCによって分離される。質量スペクトル断片化パターンは、MSを用いて各成分について得られる。これらの質量スペクトルを質量スペクトルデータベースと比較することにより、香りマークの成分を仮に特定することができる。オートサンプラーを使用して、複数のサンプルを一貫した方法でバッチで分析することができます。
SPME繊維の各タイプが極性化学物質との親和性が異なることを考えると、繊維は通常、対象の化学化合物の極性および/または分子量に応じて選択されます。また、GCカラムの種類や対象の化学化合物の特性によってGC条件も変化します。
この技術により、サンプル中の成分の分離と仮識別を可能にし、続いてピーク面積比を分析して、シグナリングに関与する可能性のある香りマーキングの成分を示す傾向を探すことによって、香りマーキングの揮発性成分の半定量的分析が可能になります。
この現在のアプローチの主な強みは次のとおりです。
- 分析できるサンプルタイプの範囲。
- 複雑なサンプル調製や抽出は必要ありません。
- 揮発性成分を分析する機能。
- 混合物の成分を分離する能力。
- 検出されたコンポーネントを識別できるように。
- 検出されたコンポーネントに関する半定量的および定量的な情報を提供する能力。
Protocol
Representative Results
Discussion
コントロールサンプルの使用は、サンプル収集時に作成された環境制御とシステムブランクの両方で、香りマークサンプルの解釈にとって非常に重要です。サンプリング環境またはインストゥルメンタルシステムに起因するピークは、目的のピークのみが任意の解釈に含まれるように、香りマークサンプルから除外する必要があります。これらのコントロールは、計測器の「健康」を評価し?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ビデオの制作のためにロザリンドフランクリン科学センター、ウォルヴァーハンプトン、ベンマントルでの化学分析に彼の支援のためにキースホールディングに感謝します。また、グロリアーナノ・モネティ教授、ジュゼッペ・ピエラッチーニ博士、フィレンツェ大学質量分析センターのメンバー、CNRのARCAラボ(フィレンツェ)のルカ・カラマイ教授とマルコ・ミケロッツィ博士に感謝しています。原稿に記載されているサンプリングと分析方法を含む研究プロジェクトは、2つのマリー・スクウォトフスカ・キュリー・イントラ・ヨーロピアン・フェローシップ(助成金契約ID:327083、703611)、英国霊長類協会からの小さな助成金(‘感覚的に豊かな霊長類‘)、そして小さな研究助成金(‘狩猟採集者は特別な匂いを持っていますか?この方法論を設定するために必要なラボの作業は、理工学部の年次資金調達コンペティション(ウォルヴァーハンプトン)からS.V.への資金も受け取りました。
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
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- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
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