Bemonstering en analyse van geursignalen van dieren
Summary
We hebben een effectieve methodologie ontwikkeld voor het bemonsteren en analyseren van geursignalen om te begrijpen hoe ze kunnen worden gebruikt in diercommunicatie. In het bijzonder gebruiken we headspace solid-phase microextractie in combinatie met gaschromatografie-massaspectrometrie om de vluchtige componenten van dierlijke geuren en geurmarkeringen te analyseren.
Abstract
We hebben een effectieve methodologie ontwikkeld voor het bemonsteren en analyseren van geursignalen, door gebruik te maken van headspace solid-phase microextractie in combinatie met gaschromatografie-massaspectrometrie, om te begrijpen hoe ze kunnen worden gebruikt in dierlijke communicatie. Deze techniek maakt de semi-kwantitatieve analyse van de vluchtige componenten van geurafscheidingen mogelijk door de scheiding en voorlopige identificatie van de componenten in het monster mogelijk te maken, gevolgd door de analyse van piekgebiedverhoudingen om te zoeken naar trends die verbindingen kunnen betekenen die betrokken kunnen zijn bij signalering. De belangrijkste sterke punten van deze huidige aanpak zijn het bereik van steekproeftypen die kunnen worden geanalyseerd; het ontbreken van een complexe monstervoorbereiding of extracties; het vermogen om de componenten van een mengsel te scheiden en te analyseren; de identificatie van de gedetecteerde componenten; en de mogelijkheid om semi-kwantitatieve en potentieel kwantitatieve informatie te verstrekken over de gedetecteerde componenten. De belangrijkste beperking van de methodologie heeft betrekking op de monsters zelf. Aangezien de componenten van specifiek belang volatiel zijn en deze gemakkelijk verloren kunnen gaan of hun concentraties kunnen worden gewijzigd, is het belangrijk dat de monsters na het verzamelen op de juiste manier worden opgeslagen en vervoerd. Dit betekent ook dat de opslag- en transportomstandigheden van monsters relatief duur zijn. Deze methode kan worden toegepast op een verscheidenheid aan monsters (waaronder urine, uitwerpselen, haar en geur-klier geur afscheidingen). Deze geuren bestaan uit complexe mengsels, die voorkomen in een reeks matrices, en vereisen dus het gebruik van technieken om de afzonderlijke componenten te scheiden en de verbindingen van biologisch belang te extraheren.
Introduction
Er is zeer weinig bekend over de chemische veranderingen die ten grondslag liggen aan de reuksignalen bij dieren1, ook vanwege methodologische uitdagingen bij het registreren en kwantificeren van vluchtige chemische profielen van geuren2. Er zijn verschillende mogelijke valkuilen bij het werken met zeer complexe, chemische matrices; deze omvatten bij het bemonsteren en analyseren van de geurmonsters3.
In het Rosalind Franklin Science Center, University of Wolverhampton, zijn we bezig met de analyse van geuren en geurmerken om te begrijpen hoe ze door dieren kunnen worden gebruikt. We combineren semiochemie met gedragsecologie, endocrinologie en cytologie om ons begrip van de rol van reuksignalen in dierlijke communicatie te verbeteren.
We hebben een methodologie ontwikkeld en vervolgens geuren en markeringen geanalyseerd van verschillende soorten, waaronder verschillende niet-menselijke primaten (d.w.z. gekroonde maki’s, roodharige maki’s, Japanse makaken, olijfbavianen, chimpansees) en andere zoogdieren (d.w.z. katten, koeien). We hebben een verscheidenheid aan monsters verzameld en geanalyseerd, waaronder urine, uitwerpselen, haar en geur-klier geur afscheidingen. Deze geuren en geurmerken bestaan uit complexe mengsels van verbindingen en daarom moet elke methodologie die voor hun analyse wordt gebruikt, een vorm van separatorietechniek bevatten. Zoals geïllustreerd, komen ze ook voor in een reeks matrices die het gebruik van technieken vereisen om de componenten van belang te extraheren.
Eerdere studies van Vaglio et al.4 en andere auteurs5 gebruikten dynamische headspace-extractie (DHS) met gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), terwijl ook directe oplosmiddelextractie6 en complexe oplosmiddelextracties7 zijn gebruikt. Bij dynamische headspacebemonstering gaat het met name om het zuiveren van de headspace met een bekend volume inert gas dat uiteindelijk alle vluchtige stoffen verwijdert, met uitzondering van die welke een sterke affiniteit voor de monstermatrix vertonen (bijvoorbeeld polaire verbindingen in waterige monsters).
Voor de huidige methodologie hebben we de techniek van headspace solid-phase microextractie (HS-SPME) in combinatie met GC-MS overgenomen. In het bijzonder hebben we de methodologie ontwikkeld en verbeterd die al door Vaglio et al. werd gebruikt in zijn vorige GC-MS-laboratorium8,9,10.
Oplosmiddelloze extractietechnieken zijn zeer effectief voor het analyseren van kleine, zeer vluchtige verbindingen (die anders gemakkelijk uit een monster kunnen worden verloren) omdat deze methoden verbindingen immobiliseren op een stabiele, solide faseondersteuning. De HS-SPME maakt gebruik van een vezel bedekt met een adsorberend polymeer om vluchtige stoffen in de monsterhoofdruimte op te vangen of om opgeloste verbindingen te extraheren door onderdompeling in een waterige biologische vloeistof11. De polymeercoating bindt de verbindingen niet sterk, daarom kunnen ze door verhitting in de injectiepoort van de GC worden verwijderd. Deze methode is krachtiger dan oplosmiddelextractietechnieken en ook effectiever dan DHS.
In de huidige aanpak zitten monsters in glazen flacons. Deze flacons worden opgewarmd tot een temperatuur van 40 °C om de lichaamstemperatuur van de dieren te simuleren om de vluchtige componenten van de geurmarkering te bevorderen om de hoofdruimte van de flacon in te nemen. Een SPME-vezel, bedekt met 65 μm polydimethylsiloxaan/divinylbenzeen (PDMS/DVB) sorbentmateriaal, wordt blootgesteld aan de headspace-omgeving en vluchtige componenten uit het monster worden op de vezel geadsorbeerd. Bij het verwarmen van de vezel in de inlaatpoort van een GC-MS worden de vluchtige componenten uit de vezel gedesorbeerd en vervolgens gescheiden door de GC. Massaspectrale fragmentatiepatronen worden verkregen voor elk onderdeel met behulp van de MS. Door deze massaspectra te vergelijken met massaspectraal databases, kan het mogelijk zijn om voorlopig de componenten van het geurmerk te identificeren. Door het gebruik van een auto-sampler zijn we in staat om meerdere samples in batches op een consistente manier te analyseren.
Aangezien elk type SPME-vezel een andere affiniteit heeft met polaire chemicaliën, wordt de vezel meestal gekozen afhankelijk van de polariteit en/ of het molecuulgewicht van de doelchemische verbindingen. Bovendien worden de GC-omstandigheden gewijzigd afhankelijk van het type GC-kolom en de kenmerken van de doelchemische verbindingen.
Deze techniek maakt de semi-kwantitatieve analyse van de vluchtige componenten van geurmarkeringen mogelijk door de scheiding en voorlopige identificatie van de componenten in het monster mogelijk te maken, gevolgd door de analyse van piekgebiedverhoudingen om te zoeken naar trends die componenten van de geurmarkering kunnen betekenen die betrokken kunnen zijn bij signalering.
De belangrijkste sterke punten van deze huidige aanpak zijn:
- Het bereik van voorbeeldtypen die kunnen worden geanalyseerd.
- Er zijn geen complexe monstervoorbereidingen of extracties nodig.
- Het vermogen om vluchtige componenten te analyseren.
- De mogelijkheid om de componenten van een mengsel te scheiden.
- Om de gedetecteerde componenten te kunnen identificeren.
- De mogelijkheid om semi-kwantitatieve en potentieel kwantitatieve informatie te verstrekken over de gedetecteerde componenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gebruik van controlemonsters, zowel milieucontroles die zijn gemaakt op het moment van monsterverzameling als systeem blanks, zijn cruciaal voor de interpretatie van de geurmerkmonsters. Pieken die worden toegeschreven aan de bemonsteringsomgeving of het instrumentele systeem moeten worden uitgesloten van geursponsmonsters, zodat alleen de pieken van belang in elke interpretatie worden opgenomen. Deze controles kunnen ook een rol spelen bij het beoordelen en monitoren van de “gezondheid” van de instrumentatie.
<p…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Keith Holding voor zijn hulp bij chemische analyses in het Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton, en Ben Mantle voor de productie van de video. We zijn ook prof. Gloriano Moneti, dr. Giuseppe Pieraccini en de leden van het Mass Spectrometry Center van de Universiteit van Florence, Florence, en prof. Luca Calamai en dr. Marco Michelozzi van het ARCA Lab van de CNR, Florence, dankbaar voor hun hulp bij het opzetten van deze methodologie. De onderzoeksprojecten die de in het manuscript beschreven bemonsterings- en analysemethoden omvatten, werden ondersteund door twee Marie Skłodowska-Curie Intra European Fellowships (Grant Agreement ID’s: 327083, 703611), een kleine beurs (‘The sensory enriched primate‘) van de Primate Society of Great Britain en een kleine onderzoeksbeurs (‘Hebben jager-verzamelaars een speciaal reukvermogen?‘) van de British Academy/The Leverhulme Trust aan S.V. Het laboratoriumwerk dat nodig was om deze methodologie op te zetten, ontving ook financiering van de Jaarlijkse Financieringswedstrijd van de Faculteit Bètawetenschappen en Ingenieurs (Wolverhampton) aan S.V.
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. . Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The “secret” in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. . Solid phase microextraction: theory and practice. , (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
