דגימה וניתוח של אותות ריח בעלי חיים
Summary
פיתחנו מתודולוגיה יעילה לדגימה וניתוח של אותות ריח כדי להבין כיצד ניתן להשתמש בהם בתקשורת בין בעלי חיים. במיוחד, אנו משתמשים במיקרו-אינטרנצ’רציה מוצקה של מרחב הראש יחד עם ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה כדי לנתח את הרכיבים הנדיפים של ריחות בעלי חיים וסימוני ריח.
Abstract
פיתחנו מתודולוגיה יעילה לדגימה וניתוח של אותות ריח, באמצעות microextraction שלב מוצק headspace בשילוב עם ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה, כדי להבין כיצד הם עשויים לשמש בתקשורת בעלי חיים. טכניקה זו מאפשרת ניתוח חצי כמותי של הרכיבים הנדיפים של הפרשות ריח על ידי מתן אפשרות הפרדה וזיהוי זמני של הרכיבים במדגם, ואחריו ניתוח של יחסי אזור שיא לחפש מגמות שיכולות לסמן תרכובות שעשויות להיות מעורבות באיתות. נקודות החוזק העיקריות של גישה נוכחית זו הן טווח סוגי המדגמים שניתן לנתח; חוסר הצורך בהכנה או עקירות מדגם מורכבות; היכולת להפריד ולנתח את מרכיבי התערובת; זיהוי הרכיבים שזוהו; והיכולת לספק מידע חצי-כמותי ופוטנציאלי כמותי על הרכיבים שזוהו. המגבלה העיקרית למתודולוגיה מתייחסת לדגימות עצמן. מכיוון שמרכיבי הריבית הספציפית הם תנודתיים, ואלה עלולים בקלות ללכת לאיבוד, או שהריכוזים שלהם ישתנו, חשוב שהדגימות יאוחסנו ויעברו כראוי לאחר האיסוף שלהם. משמעות הדבר היא גם שתנאי האחסון וההובלה לדוגמה יקרים יחסית. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של דגימות (כולל שתן, צואה, הפרשות ריח של שיער ובלוטת ריח). ריחות אלה מורכבים מתערובות מורכבות, המתרחשות במגוון מטריצות, ובכך מחייבות שימוש בטכניקות להפרדת הרכיבים הבודדים ולחילוץ תרכובות בעלי עניין ביולוגי.
Introduction
מעט מאוד ידוע על השינויים הכימיים העומדים ביסוד אותות הריח בבעליחיים 1, גם בגלל אתגרים מתודולוגיים בהקלטה וכימות פרופילים כימיים נדיפים של ריחות2. ישנן מספר מלכודות פוטנציאליות בעת עבודה עם מטריצות כימיות מורכבות ביותר; אלה כוללים בעת דגימה וניתוח דגימות ריח3.
במרכז המדע ע”ש רוזלינד פרנקלין, אוניברסיטת וולברהמפטון, אנו מבצעים ניתוח של ריחות וסימני ריח כדי להבין כיצד בעלי חיים יכולים להשתמש בהם. אנו משלבים סמיוכימיה עם אקולוגיה התנהגותית, אנדוקרינולוגיה וציטולוגיה כדי לשפר את הבנתנו את התפקיד שמילאו אותות חוש הריח בתקשורת בין בעלי חיים.
פיתחנו מתודולוגיה ולאחר מכן ניתחנו ריחות וסימונים ממגוון מינים כולל כמה פרימטים לא אנושיים (כלומר, למורים מוכתרים, למורים אדומי עור, קופי מקוק יפניים, בבונים זיתים, שימפנזים) ויונקים אחרים (כלומר, חתולים, פרות). אספנו וניתחנו מגוון דגימות, כולל שתן, צואה, הפרשות ריח של שיער ובלוטת ריח. ריחות וסימני ריח אלה מורכבים מתערובות מורכבות של תרכובות ולכן כל מתודולוגיה המשמשת לניתוח שלהם צריכה לכלול צורה כלשהי של טכניקה הפרדה. כפי שמודגם, הם מתרחשים גם במגוון מטריצות המחייב שימוש בטכניקות כדי לחלץ את מרכיבי העניין.
מחקריםקודמים על ידי Vaglio et al. 4 ומחברים אחרים5 השתמשו מיצוי מרחב ראש דינמי (DHS) עם ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה (GC-MS) בעוד מיצוי ממס ישיר6 עקירות ממס מורכבים7 שימשו גם. במיוחד, דגימת headspace דינמית כרוכה בטיהור מרחב הראש עם נפח ידוע של גז אינרטי שבסופו של דבר מסיר את כל התרכובות הנדיפות למעט אלה המראות זיקה חזקה למטריצה לדוגמה (לדוגמה, תרכובות קוטביות בדגימות מימיות).
עבור המתודולוגיה הנוכחית, אימצנו את הטכניקה של מרחב ראש מוצק שלב microextraction (HS-SPME) יחד עם GC-MS. בפרט, פיתחנו ושיפרנו את המתודולוגיה שכבר נעשה בה שימוש על ידי Vaglio et al. במעבדת GC-MS הקודמת שלה8,9,10.
טכניקות מיצוי ממס יעילים מאוד לניתוח תרכובות קטנות, נדיפות מאוד (אשר אחרת ניתן לאבד בקלות מדגם) כי שיטות אלה לשתק תרכובות על תמיכה יציבה, שלב מוצק. HS-SPME משתמש בסיבים מצופים פולימר סופח כדי ללכוד תרכובות נדיפות במרחב הראש מדגם או כדי לחלץ תרכובות מומסות על ידי טבילה בנוזל ביולוגימימית 11. ציפוי פולימר אינו קושר את התרכובות בחוזקה, ולכן על ידי חימום ביציאת ההזרקה של GC הם יכולים להיות מוסרים. שיטה זו היא חזקה יותר מאשר טכניקות מיצוי ממס וגם יעיל יותר מאשר DHS.
בגישה הנוכחית דגימות כלולות בתוך בקבוקוני זכוכית. בקבוקונים אלה מחוממים לטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס כדי לדמות את טמפרטורת הגוף של בעלי החיים על מנת לקדם את הרכיבים הנדיפים של סימן הריח כדי לכבוש את ראש החלל של הבקבוקון. סיב SPME, מצופה 65 מיקרומטר של חומר סורבנט polydimethylsiloxane/divinylbenzene (PDMS/DVB), נחשף לסביבת headspace ורכיבים נדיפים מהמדגם נספגים על הסיבים. על חימום הסיבים ביציאת הכניסה של GC-MS, הרכיבים הנדיפים הם desorbed מן הסיבים ולאחר מכן מופרדים על ידי GC. דפוסי פיצול ספקטרליים של מסה מתקבלים עבור כל רכיב באמצעות MS. בהשוואה של ספקטרום מסה אלה מול מסדי נתונים ספקטרליים המוניים, ניתן לזהות באופן לא סופי את מרכיבי סימן הריח. באמצעות דוגם אוטומטי, אנו מסוגלים לנתח דגימות מרובות בקבוצות באופן עקבי.
בהתחשב בכך שלכל סוג של סיבי SPME יש זיקה שונה לכימיקלים קוטביים, הסיבים נבחרים בדרך כלל בהתאם לקוטביות ו/או המשקל המולקולרי של התרכובות הכימיות המשמשות כיעד. בנוסף, תנאי GC משתנים בהתאם לסוג עמודת GC ואת המאפיינים של תרכובות כימיות היעד.
טכניקה זו מאפשרת ניתוח חצי-כמותי של הרכיבים הנדיפים של סימוני ריח על-ידי מתן אפשרות להפרדה וזיהוי זמני של הרכיבים במדגם, ולאחר מכן ניתוח יחסי אזור שיא כדי לחפש מגמות שיכולות לסמן רכיבים של סימון הריח שעשויים להיות מעורבים באיתות.
נקודות החוזק העיקריות של גישה נוכחית זו הן:
- טווח הסוגים לדוגמה שניתן לנתח.
- אין צורך בהכנה או עקירות מדגם מורכבות.
- היכולת לנתח רכיבים נדיפים.
- היכולת להפריד את מרכיבי התערובת.
- כדי שתוכל לזהות את הרכיבים שזוהו.
- היכולת לספק מידע חצי כמותי ופוטנציאלי כמותי על הרכיבים שזוהו.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש בדגימות בקרה, הן בקרות סביבתיות שנוצרו בזמן איסוף הדגימה והן כדורי סרק של המערכת, חיוניים לפרשנות דגימות סימן הריח. כל הפסגות המיוחסות לסביבת הדגימה או למערכת האינסטרומנטלית צריכות להיות מודרות מדגימות סימן ריח, כך שרק פסגות העניין נכללות בכל פרשנות. פקדים אלה יכולים גם לשחק תפקיד …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לקית’ הולדינג על עזרתו בניתוחים כימיים במרכז המדע ע”ש רוזלינד פרנקלין, וולברהמפטון ובן מנטל על הפקת הסרטון. אנו מודים גם לפרופ’ גלוריאנו מונטי, ד”ר ג’וזפה פייראצ’יני ולחברי המרכז לספקטרומטריית מסה באוניברסיטת פירנצה, פירנצה, ולפרופ’ לוקה קלמאי וד”ר מרקו מיכאלוצי ממעבדת ARCA של CNR, פירנצה, על עזרתם בהקמת מתודולוגיה זו. פרויקטי המחקר שכללו את שיטות הדגימה והניתוח המתוארות בכתב היד נתמכו על ידי שתי מלגות מארי סקלודובסקי-קירי אינטרה אירופאיות (תעודות זהות של הסכם מענק: 327083, 703611), מענק קטן (‘הפרימט המועשר החושי‘) מאגודת הפרימטים של בריטניה הגדולה, ומענק מחקר קטן (‘האם לציידים-לקטים יש חוש ריח מיוחד?‘) מהאקדמיה הבריטית / קרן Leverhulme ל S.V. עבודת המעבדה הדרושה להקמת מתודולוגיה זו קיבלה גם מימון מתחרות המימון השנתית של הפקולטה למדעים והנדסה (וולברהמפטון) ל-S.V.
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. . Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The “secret” in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. . Solid phase microextraction: theory and practice. , (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
