Prøvetaking og analyse av animalske duftsignaler
Summary
Vi har utviklet en effektiv metodikk for prøvetaking og analyse av luktsignaler for å forstå hvordan de kan brukes i dyrekommunikasjon. Spesielt bruker vi headspace solid-phase mikroekstraksjon kombinert med gasskromatografi-massespektrometri for å analysere de flyktige komponentene i dyrelukt og duftmarkeringer.
Abstract
Vi har utviklet en effektiv metodikk for prøvetaking og analyse av luktsignaler, ved å bruke fastfasemikroekstraksjon i hoderommet kombinert med gasskromatografi-massespektrometri, for å forstå hvordan de kan brukes i dyrekommunikasjon. Denne teknikken tillater semi-kvantitativ analyse av de flyktige komponentene av luktsekretjoner ved å muliggjøre separasjon og foreløpig identifisering av komponentene i prøven, etterfulgt av analyse av toppområdeforhold for å se etter trender som kan betegne forbindelser som kan være involvert i signalering. Nøkkelstyrkene ved denne gjeldende tilnærmingen er utvalget av utvalgstyper som kan analyseres. mangelen på behov for komplekse prøvepreparater eller ekstraksjoner; evnen til å skille og analysere komponentene i en blanding; identifikasjonen av komponentene som ble oppdaget; og muligheten til å gi semi-kvantitativ og potensielt kvantitativ informasjon om komponentene som oppdages. Hovedbegrensningen på metodikken gjelder selve prøvene. Siden komponentene av spesifikk interesse er flyktige, og disse lett kan gå tapt, eller konsentrasjonene deres endres, er det viktig at prøvene lagres og transporteres på riktig måte etter innsamlingen. Dette betyr også at prøvelagrings- og transportforholdene er relativt kostbare. Denne metoden kan brukes på en rekke prøver (inkludert urin, avføring, hår og luktsekretjoner i duftkjertelen). Disse luktene består av komplekse blandinger, som forekommer i en rekke matriser, og krever dermed bruk av teknikker for å skille de enkelte komponentene og trekke ut forbindelsene av biologisk interesse.
Introduction
Svært lite er kjent om de kjemiske endringene som ligger til grunn for de olfaktoriske signalene hos dyr1, også på grunn av metodologiske utfordringer ved registrering og kvantifisering av flyktige kjemiske profiler av lukt2. Det er flere potensielle fallgruver når du arbeider med svært komplekse, kjemiske matriser; disse inkluderer ved prøvetaking og analyse av luktprøvene3.
På Rosalind Franklin Science Center, University of Wolverhampton, gjennomfører vi analysen av lukt og duftmerker for å forstå hvordan de kan brukes av dyr. Vi kombinerer semiokjemi med atferdsøkologi, endokrinologi og cytologi for å forbedre vår forståelse av rollen som spilles av olfaktoriske signaler i dyrekommunikasjon.
Vi har utviklet en metodikk og deretter analysert lukt og markeringer fra en rekke arter, inkludert flere ikke-menneskelige primater (dvs. kronede lemurer, rød-ruffed lemurer, japanske macaques, olivenbavianer, sjimpanser) og andre pattedyr (dvs. katter, kyr). Vi har samlet og analysert en rekke prøver, inkludert urin, avføring, hår og luktsekretjoner i duftkjertelen. Disse luktene og duftmerkene består av komplekse blandinger av forbindelser, og derfor må enhver metodikk som brukes til analysen, inkludere en form for separatorteknikk. Som illustrert forekommer de også i en rekke matriser som nødvendiggjør bruk av teknikker for å trekke ut komponentene av interesse.
Tidligere studier av Vaglio et al.4 og andre forfattere5 brukte dynamisk headspace extraction (DHS) med gasskromatografi-massespektrometri (GC-MS) mens direkte løsningsmiddelutvinning6 og komplekse løsningsmiddelutvinninger7 også har blitt brukt. Spesielt innebærer dynamisk hoderomsprøvetaking å rense hoderommet med et kjent volum inertgass som til slutt fjerner alle flyktige forbindelser med unntak av de som viser en sterk affinitet for prøvematrisen (for eksempel polare forbindelser i vandige prøver).
For den nåværende metodikken har vi tatt i bruk teknikken for headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) kombinert med GC-MS. Spesielt har vi utviklet og forbedret metodikken som allerede brukes av Vaglio et al. i sitt forrige GC-MS-laboratorium8,9,10.
Løsemiddelløse ekstraksjonsteknikker er svært effektive for å analysere små, svært flyktige forbindelser (som ellers kan gå tapt lett fra en prøve) fordi disse metodene immobiliserer forbindelser på en stabil, solid fasestøtte. HS-SPME bruker en fiberbelagt med en adsorbentpolymer for å fange flyktige forbindelser i prøvehoderommet eller for å trekke ut oppløste forbindelser ved nedsenking i en vandig biologisk væske11. Polymerbelegget binder ikke forbindelsene sterkt, derfor ved oppvarming i injeksjonsporten til GC kan de fjernes. Denne metoden er kraftigere enn løsningsmiddelekstraksjonsteknikker og også mer effektiv enn DHS.
I den nåværende tilnærmingen finnes prøver i glassflasker. Disse hetteglassene varmes opp til en temperatur på 40 °C for å simulere kroppstemperaturen til dyr for å fremme de flyktige komponentene i duftmerket for å okkupere hetteglassets hoderom. En SPME fiber, belagt med 65 μm polydimetylsiloksan /divinylbenzen (PDMS/DVB) sorbent materiale, er utsatt for headspace miljøet og flyktige komponenter fra prøven adsorberes på fiberen. Ved oppvarming av fiberen i innløpsporten til en GC-MS blir de flyktige komponentene desorbert fra fiberen og deretter skilt av GC. Massespektral fragmentering mønstre oppnås for hver komponent ved hjelp av MS. Ved sammenligning av disse massespektra mot massespektraldatabaser, kan det være mulig å foreløpig identifisere komponentene i duftmerket. Gjennom bruk av en auto-sampler, er vi i stand til å analysere flere prøver i partier på en konsekvent måte.
Gitt at hver type SPME fiber har en annen affinitet med polare kjemikalier, er fiberen vanligvis valgt avhengig av polariteten og / eller molekylvekten til målkjemiske forbindelser. I tillegg endres GC-forholdene avhengig av typen GC-kolonne og egenskapene til målkjemiske forbindelser.
Denne teknikken gjør det mulig for den semi-kvantitative analysen av de flyktige komponentene i duftmarkeringer ved å muliggjøre separasjon og foreløpig identifisering av komponentene i prøven, etterfulgt av analyse av toppområdeforhold for å se etter trender som kan betegne komponenter i duftmarkeringen som kan være involvert i signalering.
De viktigste styrkene ved denne nåværende tilnærmingen er:
- Utvalget av utvalgstyper som kan analyseres.
- Ingen komplekse prøvepreparater eller ekstraksjoner er nødvendig.
- Evnen til å analysere flyktige komponenter.
- Evnen til å skille komponentene i en blanding.
- For å kunne identifisere komponentene som ble oppdaget.
- Evnen til å gi semi-kvantitativ og potensielt kvantitativ informasjon om komponentene som oppdages.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bruk av kontrollprøver, både miljøkontroller opprettet på tidspunktet for prøveinnsamling og systememner, er avgjørende for tolkningen av duftmerkeprøvene. Eventuelle topper som tilskrives prøvetakingsmiljøet eller det instrumentelle systemet, må utelukkes fra duftmerkeprøver, slik at bare toppene av interesse inkluderes i enhver tolkning. Disse kontrollene kan også spille en rolle i å vurdere og overvåke instrumentets “helse”.
Protokollen inkluderer trinn for å kondisjonere fib…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Keith Holding for hans hjelp med kjemiske analyser ved Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton og Ben Mantle for produksjonen av videoen. Vi er også takknemlige til prof. Gloriano Moneti, Dr. Giuseppe Pieraccini og medlemmene av University of Florence’s Mass Spectrometry Center, Firenze, og til prof. Luca Calamai og Dr. Marco Michelozzi fra CNRs ARCA Lab, Firenze, for deres hjelp med å sette opp denne metodikken. Forskningsprosjektene som inkluderte prøvetakings- og analysemetodene beskrevet i manuskriptet ble støttet av to Marie Skłodowska-Curie Intra European Fellowships (Grant Agreement IDs: 327083, 703611), et lite tilskudd (‘Den sensoriske berikede primaten‘) fra Primate Society of Great Britain, og et lite forskningsstipend (‘Har jegersamlere en spesiell luktesans?‘) fra British Academy/The Leverhulme Trust til S.V. Laboratoriearbeidet som var nødvendig for å sette opp denne metodikken fikk også støtte fra Fakultet for vitenskap og ingeniørvitenskap (Wolverhampton) til S.V.
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. . Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The “secret” in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. . Solid phase microextraction: theory and practice. , (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
