Provtagning och analys av djurdoftsignaler
Summary
Vi har utvecklat en effektiv metodik för provtagning och analys av luktsignaler för att förstå hur de kan användas i djurkommunikation. Särskilt använder vi headspace solid-phase microextraction i kombination med gaskromatografi-masspektrometri för att analysera flyktiga komponenter i djurlukt och doftmarkeringar.
Abstract
Vi har utvecklat en effektiv metodik för provtagning och analys av luktsignaler, genom att använda huvudutrymmet fastfasmikrotraktion i kombination med gaskromatografi-masspektrometri, för att förstå hur de kan användas i djurkommunikation. Denna teknik gör det möjligt att semikvantitativ analys av flyktiga komponenter i luktsekret genom att möjliggöra separation och preliminär identifiering av komponenterna i provet, följt av analys av topparealförhållanden för att leta efter trender som kan beteckna föreningar som kan vara involverade i signalering. De viktigaste styrkorna för den här aktuella metoden är intervallet för exempel typer som kan analyseras; Bristen på behov av komplexa provberedningar eller extraktioner. Förmågan att separera och analysera komponenterna i en blandning; Identifiering av de identifierade komponenterna. och förmågan att tillhandahålla semikvantitativ och potentiellt kvantitativ information om de upptäckta komponenterna. Den huvudsakliga begränsningen av metoden gäller själva proverna. Eftersom komponenterna av särskilt intresse är flyktiga, och dessa lätt kan gå förlorade eller deras koncentrationer ändras, är det viktigt att proverna lagras och transporteras på lämpligt sätt efter insamlingen. Detta innebär också att provlagrings- och transportförhållandena är relativt kostsamma. Denna metod kan tillämpas på en mängd olika prover (inklusive urin, avföring, hår och doftkörtelluktsekret). Dessa lukter består av komplexa blandningar, som förekommer i en rad matriser, och kräver därför användning av tekniker för att separera de enskilda komponenterna och extrahera föreningar av biologiskt intresse.
Introduction
Mycket lite är känt om de kemiska förändringar som ligger till grund för luktsignalerna hos djur1, också på grund av metodologiska utmaningar vid registrering och kvantifiering av flyktiga kemiska profiler av lukt2. Det finns flera potentiella fallgropar när man arbetar med mycket komplexa, kemiska matriser; Dessa inkluderar vid provtagning och analys av luktproverna3.
Vid Rosalind Franklin Science Center, University of Wolverhampton, genomför vi analysen av lukt och doftmärken för att förstå hur de kan användas av djur. Vi kombinerar semiochemistry med beteendeekologi, endokrinologi och cytologi för att förbättra vår förståelse av den roll som luktsignaler spelar i djurkommunikation.
Vi har utvecklat en metodik och sedan analyserat lukt och markeringar från en mängd olika arter, inklusive flera icke-mänskliga primater (dvs. krönta lemurer, rödruffade lemurer, japanska makaker, oliv babianer, schimpanser) och andra däggdjur (dvs. katter, kor). Vi har samlat in och analyserat en mängd olika prover, inklusive urin, avföring, hår och doftkörtelluktsekret. Dessa lukter och doftmärken består av komplexa blandningar av föreningar och därför måste alla metoder som används för deras analys innehålla någon form av separatory teknik. Som illustreras förekommer de också i en rad matriser som kräver användning av tekniker för att extrahera komponenter av intresse.
Tidigare studier av Vaglio et al.4 och andraförfattare 5 använde dynamiska headspace extraktion (DHS) med gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS) medan direkt lösningsmedelextraktion 6 och komplexa lösningsmedelextraktioner 7 har också använts. Särskilt dynamisk huvudutrymmesprovtagning innebär att huvudutrymmet rensas med en känd volym inert gas som i slutändan avlägsnar alla flyktiga föreningar, med undantag för de som visar en stark affinitet för provmatrisen (till exempel polära föreningar i vattenhaltiga prover).
För den nuvarande metoden har vi antagit tekniken för headspace solid-phase microextraction (HS-SPME) i kombination med GC-MS. I synnerhet har vi utvecklat och förbättrat den metod som redan används av Vaglio et al. i dess tidigare GC-MS-laboratorium8,9,10.
Lösningsmedelslösa extraktionstekniker är mycket effektiva för att analysera små, mycket flyktiga föreningar (som annars lätt kan gå förlorade från ett prov) eftersom dessa metoder immobiliserar föreningar på ett stabilt, fast fasstöd. HS-SPME använder en fiber belagd med en adsorbentpolymer för att fånga flyktiga föreningar i provhuvudutrymmet eller för att extrahera upplösta föreningar genom nedsänkning i en vattenhaltig biologiskvätska 11. Polymerbeläggningen binder inte föreningarna starkt, därför genom uppvärmning i injektionsporten på GC kan de avlägsnas. Denna metod är kraftfullare än lösningsmedelsextraktionstekniker och också effektivare än DHS.
I den nuvarande metoden finns prover i glasflaskor. Dessa injektionsflaskar värms upp till en temperatur av 40 °C för att simulera djurkroppstemperaturen för att främja de flyktiga komponenterna i doftmärket för att uppta injektionsflaskans huvudutrymme. En SPME-fiber, belagd med 65 μm polydietylsiloxan/divinylbensen (PDMS/DVB) sorbentmaterial, utsätts för huvudutrymmets miljö och flyktiga komponenter från provet adsorberas på fibern. Vid uppvärmning av fibern i inloppsporten på en GC-MS desorberas de flyktiga komponenterna från fibern och separeras sedan av GC. Masspektrala fragmenteringsmönster erhålls för varje komponent som använder MS. Som jämförelse av dessa masspektra mot masspektratdatabaser kan det vara möjligt att preliminärt identifiera komponenterna i doftmärket. Genom att använda en autoprovtagare kan vi analysera flera prover i omgångar på ett konsekvent sätt.
Med tanke på att varje typ av SPME-fiber har en annan affinitet med polära kemikalier väljs fibern vanligtvis beroende på polariteten och/eller molekylvikten hos målkemikaliens föreningar. Dessutom ändras GC-förhållandena beroende på typen av GC-kolumn och egenskaperna hos målkemikaliens föreningar.
Denna teknik gör det möjligt att halvkvantitativ analys av de flyktiga komponenterna i doftmarkeringar genom att möjliggöra separation och preliminär identifiering av komponenterna i provet, följt av analys av topparealförhållanden för att leta efter trender som kan beteckna komponenter i doftmärkningen som kan vara involverade i signalering.
De viktigaste styrkorna i detta nuvarande tillvägagångssätt är:
- Det intervall av exempeltyper som kan analyseras.
- Inga komplexa provberedningar eller extraktioner krävs.
- Förmågan att analysera flyktiga komponenter.
- Förmågan att separera komponenterna i en blandning.
- För att kunna identifiera de identifierade komponenterna.
- Förmågan att tillhandahålla semikvantitativ och potentiellt kvantitativ information om de identifierade komponenterna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användningen av kontrollprover, både miljökontroller som skapades vid tidpunkten för provtagningen och systemämnen, är avgörande för tolkningen av doftmärkesproverna. Alla toppar som tillskrivs provtagningsmiljön eller det instrumentella systemet måste undantas från doftmärkesprover så att endast de toppar som är av intresse inkluderas i någon tolkning. Dessa kontroller kan också spela en roll när det gäller att bedöma och övervaka instrumenteringens “hälsa”.
Protokollet …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Keith Holding för hans hjälp med kemiska analyser på Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton och Ben Mantle för produktionen av videon. Vi är också tacksamma mot prof. Gloriano Moneti, Dr. Giuseppe Pieraccini och medlemmarna i University of Florence’s Mass Spectrometry Center, Florens, och till prof. Luca Calamai och Dr. Marco Michelozzi vid CNR: s ARCA Lab, Florens, för deras hjälp med att sätta upp denna metodik. De forskningsprojekt som omfattade de provtagnings- och analysmetoder som beskrivs i manuskriptet stöddes av två Marie Skłodowska-Curie Intra European Fellowships (Grant Agreement ID: 327083, 703611), ett litet anslag (“The sensory berikade primater‘) från Primate Society of Great Britain, och ett litet forskningsanslag (‘Har jägar-samlare en speciell luktsinne?‘) från British Academy/The Leverhulme Trust till S.V. Det labbarbete som behövdes för att inrätta denna metod fick också finansiering från Fakulteten för vetenskap och tekniks årliga finansieringstävling (Wolverhampton) till S.V.
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
- Wyatt, T. D. . Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).
- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
- Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. The “secret” in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication. American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).
- Vaglio, S., et al. Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills. Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).
- Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).
- Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses. Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).
- Kimura, R. Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses. Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).
- Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition. Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).
- Setchell, J. M., et al. Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity. Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).
- Setchell, J. M., et al. Odour signals MHC genotype in an Old World monkey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).
- Pawliszyn, J. . Solid phase microextraction: theory and practice. , (1997).
- Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs. American Journal of Primatology. 81 (1), 22951 (2019).
