نمو المعادن المحدودة من السيلان نيسيريا لتوصيف الجينات المتجاوبة مع المعادن واقتناء المعادن من ليغاندس المضيف
Summary
نحن نصف هنا طريقة لنمو السيلان Neisseria في المتوسط السائل المقيد بالمعادن لتسهيل التعبير عن الجينات للحصول على المعادن. كما نحدد تجارب المصب لتوصيف النمط الظاهري لـ “الـ”أنوسكوات” التي تزرع في هذه الظروف. ويمكن تكييف هذه الأساليب لتكون مناسبة لتوصيف الجينات المتجاوبة مع المعادن في البكتيريا الأخرى.
Abstract
المعادن النزرة مثل الحديد والزنك هي العناصر الغذائية الحيوية المعروفة للعب أدوار رئيسية في العمليات prokaryotic بما في ذلك تنظيم الجينات، والحفز، وبنية البروتين. عزل المعادن من قبل المضيفين غالبا ما يؤدي إلى قيود معدنية للبكتيريا. هذا القيد يحفز التعبير الجيني البكتيري الذي تسمح منتجات البروتين للبكتيريا بالتغلب على بيئتها المحدودة بالمعادن. وتوصيف هذه الجينات أمر صعب. يجب أن تزرع البكتيريا في وسائل الإعلام المعدة بدقة التي تسمح بالوصول الكافي إلى المعادن الغذائية للسماح بنمو البكتيريا مع الحفاظ على التشكيل الجانبي المعدني مما يؤدي إلى تحقيق التعبير عن الجينات المذكورة أعلاه. وعلى هذا النحو، يجب إقامة توازن دقيق لتركيزات هذه المعادن. نمو كائن سريع التغذية مثل السيلان Neisseria، الذي تطور للبقاء على قيد الحياة فقط في المضيف البشري ، يضيف مستوى إضافي من التعقيد. هنا ، نصف إعداد متوسط محدد محدود بالمعادن يكفي للسماح بنمو المكورات الغونوكولية والتعبير الجيني المطلوب. تسمح هذه الطريقة للمحقق برش الحديد والزنك من مصادر غير مرغوب فيها مع استكمال وسائل الإعلام بمصادر محددة من الحديد أو الزنك ، والتي يتم وصف إعدادها أيضًا. وأخيراً، نحدد ثلاث تجارب تستخدم هذه الوسائط للمساعدة في توصيف منتجات البروتين للجينات المكورات الغونية المنظمة بالمعادن.
Introduction
النيسيريا السيلان يسبب السيلان العدوى الشائعة التي تنتقل عن طريق الاتصال الجنسي. أثناء العدوى ، تعبر Neisseria المسببة للأمراض عن ذخيرة من الجينات المتجاوبة مع المعادن التي تسمح للبكتيريا بالتغلب على جهود تقييد المعادن من قبل المضيف البشري1،2،3. المعادن النزرة مثل الحديد والزنك تلعب أدوارا رئيسية في العديد من العمليات الخلوية، مثل ربط الإنزيمات في المواقع الحفازة، والمشاركة في ردود فعل الأكسدة، والعوامل الهيكلية في مختلف البروتينات4،5. في ظروف محدودة المعدن، يتم إلغاء قمع loci المتجاوبة مع المعادن ويمكن أن تساعد البروتينات الناتجة عن ذلك في الحصول على هذه العناصر الغذائية. ويمثل توصيف هذه الجينات والبروتينات تحديا تقنيا فريدا للمحقق. يجب حجب الأيونات المعدنية عن البكتيريا من أجل الحث على نسخ هذه الجينات من loci الأصلية ، ولكن يمكن أن يكون من الصعب تحسين الاستخلاب الفعال لهذه الأيونات من الوسائط المحملة بالمعادن. الملامح المعدنية المختلفة من مصدر المياه ومتأصلة الكثير إلى الكثير الاختلاف6 من المكونات مسحوق يعني أن كمية من chelator المطلوبة لإزالة معدن معين من وسط غني سوف تختلف بين مواقع مختلفة، وبائعي المكونات، وحتى مع مرور الوقت داخل مختبر واحد كما يتم استبدال المخزون الكيميائي.
للتحايل على هذا التحدي، ونحن نصف إعداد وسيلة محددة التي يتم التعامل مع Chelex-100 الراتنج أثناء التحضير لإزالة المعادن النزرة من الحل. هذه الوسيلة كثيفة المغذيات بما فيه الكفاية للسماح لنمو المكورات البنية ، والتي يصعب الاستزراع خارج المضيف البشري ، وتتيح للمحقق إدخال ملف معدني محدد بإضافة مصادرها المحددة وتركيزاتها الخاصة المعادن. وتزيد طريقة إضافة المعادن المطلوبة إلى المتوسطة المستنفدة من الاتساق التجريبي وتسمح بإجراء تجارب قوية وقابلة للتكرار بغض النظر عن عوامل مثل مصدر المياه وأرقام اللوت الكيميائية. وعلاوة على ذلك، يمكن نشر هذه الوسائط إما سائلة أو صلبة مع تعديلات طفيفة فقط، مما يجعلها متعددة الاستخدامات.
من أجل إظهار فائدة هذه الوسيلة ، نحدد بروتوكولًا لاستخدامه في نمو المكورات الغونوكولية ووصف ثلاث تجارب ناجحة لتوصيف جينات Neisseria المتجاوبة مع المعادن. أولاً، نقوم بإعداد الخلايا الغونوكولية الكاملة من الثقافات المستنفدة للمعادن أو المكملة ونظهر مستويات متغيرة من إنتاج البروتين من loci المستجيبة للمعادن. ثم نحدد مخطط النمو المقيد بالزنك حيث يتم التحكم في نمو المكورات الغونوكولية عن طريق مكملات مصادر الزنك المحددة القابلة للاستخدام. وأخيراً، نعرض الاختبارات الملزمة التي توضح الخلايا المكورات الغونية الكاملة التي تعبر عن مستقبلات سطحية مستجيبة للمعادن ملزمة للليغاندات المحتوية على المعادن الخاصة بها. عرض سطح ناجح من هذه المستقبلات يتطلب النمو في المتوسطة المستنفدة للمعادن.
تم تحسين البروتوكول الحالي خصيصًا لـ Neisseria السيلان، ولكن العديد من مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى تستخدم استراتيجيات اقتناء المعادن أثناء العدوى7، لذلك يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة التوازن المعدني في البكتيريا الأخرى. من المرجح أن يتطلب تحسين هذه الوسائط وهذه البروتوكولات التجريبية للاستخدام في البكتيريا الأخرى تعديلًا طفيفًا لتركيزات chelator المعدنية و / أو وقت المعالجة مع Chelex-100 ، حيث قد يكون للبكتيريا الأخرى متطلبات معدنية مختلفة قليلاً عن المكورات الأنوكولوسية. الحديد والزنك هي المعادن الرئيسية التي تثير القلق بالنسبة للتحقيقات الموصوفة ، ولكن المعادن الأخرى (مثل المنغنيز) أثبتت أنها حاسمة للبكتيريا ، بما في ذلك Neisseria8،9،10،11،12. وعلاوة على ذلك، تم وصف أساليب مماثلة لتوصيف المعادن في العمل زراعة الخلايا eukaryotic، والتي يمكن أيضا النظر فيها. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
وسائل الإعلام النمو يخدم مجموعة متنوعة من الأدوار في البحوث الميكروبيولوجية. وتستخدم وسائل الإعلام المتخصصة للاختيار والإثراء، والتطبيقات الأخرى المختلفة لأنواع مختلفة من الدراسة. أحد هذه التطبيقات هو تحريض الجينات المتجاوبة مع المعادن ، والتي يتم إنجازها عادة عن طريق إضافة chelator معين ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R01 AI125421، R01 AI127793، وU19 AI144182. يود كاتب الكتابة أن يشكر جميع أعضاء المختبر الذين ساهموا في التدقيق اللغوي ومراجعة هذه الطريقة.
Materials
| 125 mL sidearm flasks | Bellco | 2578-S0030 | Must be custom ordered |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | M131 | Open in fume hood |
| 3MM Paper | GE Health | 3030-6461 | Called "filter paper" in text |
| Agarose | Biolone | BIO-41025 | Powder |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | Powder |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | Powder |
| Blotting grade blocker | Bio-Rad | 170-6404 | Nonfat dry milk |
| Bovine serum albumin | Roche | 3116964001 | Powder |
| Bovine transferrin | Sigma-Aldrich | T1428 | Powder |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C5080 | Powder |
| Calcium pantothenate | Sigma-Aldrich | C8731 | Powder |
| Calprotectin | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Chelex-100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | Wash with deionized water prior to use |
| Cotton-tipped sterile swab | Puritan | 25-806 | Cotton is better than polyester for this application |
| Deferoxamine | Sigma-Aldrich | D9533 | Powder |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Powder |
| Dialysis cassette | Thermo | 66380 | Presoak in buffer prior to use |
| Dot blot apparatus | Schleicher & Schwell | 10484138 | Lock down lid as tightly as possible before sample loading |
| Ethanol | Koptec | V1016 | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Ferric chloride | Sigma-Aldrich | F7134 | Irritant, do not inhale |
| Ferric nitrate nonahydrate | Sigma-Aldrich | F1143 | Irritant, do not inhale |
| GC medium base | Difco | 228950 | Powder, already contains agar |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Powder |
| HEPES | Fisher | L-15694 | Powder |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T2030 | Powder |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | Powder |
| Klett colorimeter | Manostat | 37012-0000 | Uses color transmission to assess culture density |
| L-alanine | Sigma-Aldrich | A7627 | Powder |
| L-arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Powder |
| L-asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A8381 | Powder |
| L-aspartate | Sigma-Aldrich | A9256 | Powder |
| L-cysteine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C1276 | Powder |
| L-cystine | Sigma-Aldrich | C8755 | Powder |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G1251 | Powder |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | Powder |
| L-histidine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | H8125 | Powder |
| L-isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752 | Powder |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | Powder |
| L-lysine | Sigma-Aldrich | L5501 | Powder |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | Powder |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126 | Powder |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P0380 | Powder |
| L-serine | Sigma-Aldrich | S4500 | Powder |
| L-threonine | Sigma-Aldrich | T8625 | Powder |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | Powder |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754 | Powder |
| L-valine | Sigma-Aldrich | V0500 | Powder |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Powder |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | Flammable liquid, store in flammables cabinet |
| Nitrocellulose | GE Health | 10600002 | Keep in protective sheath until use |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 60356 | Powder |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | Powder |
| Potassium sulfate | Sigma-Aldrich | P0772 | Powder |
| Potato starch | Sigma-Aldrich | S4251 | Powder |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G4251 | Handle carefully. Can oxidize easily. |
| S100A7 | N/A | N/A | We are supplied with this by a collaborator |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder |
| Sodium chloride | VWR | 470302 | Powder |
| Sodium citrate | Fisher | S279 | Powder |
| Sodium hydroxide | Acros Organics | 383040010 | Highly hygroscopic |
| Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | Powder |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Also called cocarboxylase |
| TPEN | Sigma-Aldrich | P4413 | Powder |
| Tris | VWR | 497 | Powder |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | Powder |
| Zinc sulfte heptahydrate | Sigma-Aldrich | 204986 | Irritant, do not inhale |
References
- Cornelissen, C. N. Subversion of nutritional immunity by the pathogenic Neisseriae. Pathogens and Disease. 76 (1), (2018).
- Ducey, T. F., Carson, M. B., Orvis, J., Stintzi, A. P., Dyer, D. W. Identification of the iron-responsive genes of Neisseria gonorrhoeae by microarray analysis in defined medium. Journal of Bacteriology. 187 (14), 4865-4874 (2005).
- Pawlik, M. C., et al. The zinc-responsive regulon of Neisseria meningitidis comprises 17 genes under control of a Zur element. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6594-6603 (2012).
- Andreini, C., Banci, L., Bertini, I., Rosato, A. Zinc through the three domains of life. Journal of Proteome Research. 5 (11), 3173-3178 (2006).
- Frawley, E. R., Fang, F. C. The ins and outs of bacterial iron metabolism. Molecular Microbiology. 93 (4), 609-616 (2014).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-Lot Variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nature Reviews Microbiology. 10 (8), 525-537 (2012).
- Lopez, C. A., Skaar, E. P. The Impact of Dietary Transition Metals on Host-Bacterial Interactions. Cell Host Microbe. 23 (6), 737-748 (2018).
- Kehl-Fie, T. E., et al. MntABC and MntH contribute to systemic Staphylococcus aureus infection by competing with calprotectin for nutrient manganese. Infection and Immunity. 81 (9), 3395-3405 (2013).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Current Opinion in Chemical Biology. 14 (2), 218-224 (2010).
- Seib, K. L., et al. Defenses against oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae: a system tailored for a challenging environment. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (2), 344-361 (2006).
- Wu, H. J., et al. PerR controls Mn-dependent resistance to oxidative stress in Neisseria gonorrhoeae. Molecular Microbiology. 60 (2), 401-416 (2006).
- Rayner, M. H., Suzuki, K. T. A simple and effective method for the removal of trace metal cations from a mammalian culture medium supplemented with 10% fetal calf serum. Biometals. 8 (3), 188-192 (1995).
- Kellogg, D. S., Peacock, W. L., Deacon, W. E., Brown, L., Pirkle, D. I. Neisseria Gonorrhoeae. I. Virulence Genetically Linked to Clonal Variation. Journal of Bacteriology. 85, 1274-1279 (1963).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Heinicke, E., Kumar, U., Munoz, D. G. Quantitative dot-blot assay for proteins using enhanced chemiluminescence. Journal of Immunological Methods. 152 (2), 227-236 (1992).
- Jean, S., Juneau, R. A., Criss, A. K., Cornelissen, C. N. Neisseria gonorrhoeae Evades Calprotectin-Mediated Nutritional Immunity and Survives Neutrophil Extracellular Traps by Production of TdfH. Infection and Immunity. 84 (10), 2982-2994 (2016).
- Stork, M., et al. Zinc piracy as a mechanism of Neisseria meningitidis for evasion of nutritional immunity. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003733 (2013).
- Maurakis, S., et al. The novel interaction between Neisseria gonorrhoeae TdfJ and human S100A7 allows gonococci to subvert host zinc restriction. PLoS Pathogens. 15 (8), 1007937 (2019).
- Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Iron piracy: acquisition of transferrin-bound iron by bacterial pathogens. Molecular Microbiology. 14 (5), 843-850 (1994).
- Quillin, S. J., Seifert, H. S. Neisseria gonorrhoeae host adaptation and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 226-240 (2018).
- Platt, D. J. Carbon dioxide requirement of Neisseria gonorrhoeae growing on a solid medium. Journal of Clinical Microbiology. 4 (2), 129-132 (1976).
- Grim, K. P., et al. The Metallophore Staphylopine Enables Staphylococcus aureus To Compete with the Host for Zinc and Overcome Nutritional Immunity. MBio. 8 (5), 01281-01317 (2017).
- Helbig, K., Bleuel, C., Krauss, G. J., Nies, D. H. Glutathione and transition-metal homeostasis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 190 (15), 5431-5438 (2008).
- Calmettes, C., et al. The molecular mechanism of Zinc acquisition by the neisserial outer-membrane transporter ZnuD. Nature Communications. 6, 7996 (2015).
- Hubert, K., et al. ZnuD, a potential candidate for a simple and universal Neisseria meningitidis vaccine. Infection and Immunity. 81 (6), 1915-1927 (2013).
- Kumar, P., Sannigrahi, S., Tzeng, Y. L. The Neisseria meningitidis ZnuD zinc receptor contributes to interactions with epithelial cells and supports heme utilization when expressed in Escherichia coli. Infection and Immunity. 80 (2), 657-667 (2012).
- Stork, M., et al. An outer membrane receptor of Neisseria meningitidis involved in zinc acquisition with vaccine potential. PLoS Pathogens. 6, 1000969 (2010).
- Rosadini, C. V., Gawronski, J. D., Raimunda, D., Argüello, J. M., Akerley, B. J. A novel zinc binding system, ZevAB, is critical for survival of nontypeable Haemophilus influenzae in a murine lung infection model. Infection and Immunity. 79 (8), 3366-3376 (2011).
- Ammendola, S., et al. High-affinity Zn2+ uptake system ZnuABC is required for bacterial zinc homeostasis in intracellular environments and contributes to the virulence of Salmonella enterica. Infection and Immunity. 75 (12), 5867-5876 (2007).
- Gabbianelli, R., et al. Role of ZnuABC and ZinT in Escherichia coli O157:H7 zinc acquisition and interaction with epithelial cells. BMC Microbiology. 11, 36 (2011).
- Biswas, G. D., Anderson, J. E., Chen, C. J., Cornelissen, C. N., Sparling, P. F. Identification and functional characterization of the Neisseria gonorrhoeae lbpB gene product. Infection and Immunity. 67 (1), 455-459 (1999).
- Biswas, G. D., Sparling, P. F. Characterization of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 63 (8), 2958-2967 (1995).
- Chen, C. J., Sparling, P. F., Lewis, L. A., Dyer, D. W., Elkins, C. Identification and purification of a hemoglobin-binding outer membrane protein from Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 64 (12), 5008-5014 (1996).
- Wong, C. T., et al. Structural analysis of haemoglobin binding by HpuA from the Neisseriaceae family. Nature Communications. 6, 10172 (2015).
- Carson, S. D., Klebba, P. E., Newton, S. M., Sparling, P. F. Ferric enterobactin binding and utilization by Neisseria gonorrhoeae. Journal of Bacteriology. 181 (9), 2895-2901 (1999).
- Tseng, H. J., Srikhanta, Y., McEwan, A. G., Jennings, M. P. Accumulation of manganese in Neisseria gonorrhoeae correlates with resistance to oxidative killing by superoxide anion and is independent of superoxide dismutase activity. Molecular Microbiology. 40 (5), 1175-1186 (2001).
