Metal-Begrænset vækst af Neisseria gonorrée for karakterisering af metal-responsive gener og metal erhvervelse fra Host Ligands

Summary

Vi beskriver her en metode til vækst af Neisseria gonorrée i metal-begrænset flydende medium for at lette ekspressionen af gener for metaloptagelse. Vi skitserer også downstream eksperimenter for at karakterisere fænotype af gonococci dyrket under disse betingelser. Disse metoder kan tilpasses til at være egnet til karakterisering af metal-responsive gener i andre bakterier.

Abstract

Trace metaller såsom jern og zink er vitale næringsstoffer kendt for at spille centrale roller i prokaryotiske processer, herunder genregulering, katalyse, og protein struktur. Metal binding af værter fører ofte til metal begrænsning for bakterien. Denne begrænsning inducerer bakterielgen udtryk, hvis proteinprodukter tillader bakterier at overvinde deres metal-begrænset miljø. Karakterisering af sådanne gener er udfordrende. Bakterier skal dyrkes i omhyggeligt tilberedte medier, der giver tilstrækkelig adgang til ernæringsmæssige metaller til at tillade bakterievækst og samtidig opretholde en metalprofil, der fremmer at opnå ekspression af de førnævnte gener. Som sådan skal der skabes en hårfin balance for koncentrationerne af disse metaller. Dyrkning af en ernæringsmæssigt kræsen organisme som Neisseria gonorrée, som har udviklet sig til at overleve kun i den menneskelige vært, tilføjer en ekstra grad af kompleksitet. Her beskriver vi præparatet af et defineret metalbegrænset medium, der er tilstrækkeligt til at muliggøre gonokokvækst og det ønskede genekspression. Denne metode gør det muligt for investigator at chelate jern og zink fra uønskede kilder, mens supplere medierne med definerede kilder til jern eller zink, hvis præparat er også beskrevet. Endelig skitserer vi tre eksperimenter, der udnytter dette medie til at hjælpe med at karakterisere proteinprodukter fra metalregulerede gonokokgener.

Introduction

Neisseria gonorrée forårsager den almindelige seksuelt overførte infektion gonoré. Under infektion, patogene Neisseria udtrykke et repertoire af metal-responsive gener, der gør det muligt for bakterier til at overvinde metal begrænsning indsats af den menneskelige vært^1,2,3. Trace metaller som jern og zink spiller centrale roller i mange cellulære processer, såsom binding til enzymer i katalytiske steder, deltagelse i redox reaktioner, og som strukturelle faktorer i forskellige proteiner^4,5. Under metalbegrænsende forhold er metal-responsive loci derepressed og deres resulterende proteiner kan støtte erhvervelsen af disse næringsstoffer. Karakterisering af disse gener og proteiner udgør en unik teknisk udfordring for investigator. Metalioner skal tilbageholdes fra bakterier for at fremkalde transskription af disse gener fra deres indfødte loci, men effektiv kelation af disse ioner fra metal-laden medier kan være svært at optimere. De forskellige metalprofiler af kildevand og iboende lot-to-lot variation⁶ af pulveriserede ingredienser betyder, at mængden af chelator, der kræves for at fjerne et bestemt metal fra et rigt medie, vil variere mellem forskellige steder, ingrediensleverandører, og endda over tid inden for et enkelt laboratorium, da den kemiske beholdning udskiftes.

For at omgå denne udfordring beskriver vi udarbejdelsen af et defineret medium, der behandles med Chelex-100 harpiks under tilberedningen for at fjerne spormetaller fra opløsningen. Dette medium er tilstrækkeligt næringsstoftæt til at muliggøre vækst af gonococcus, som er vanskeligt at kultur uden for den menneskelige vært, og gør det muligt for investigator at indføre en specifik metalprofil ved at tilføje deres egne definerede kilder og koncentrationer af Metaller. Metoden til kontrolleret add-back af ønskede metaller til forarmet medium øger eksperimentel konsistens og giver mulighed for robuste, replikerbare eksperimenter uanset faktorer såsom vandkilde og kemiske partinumre. Desuden kan dette medie anvendes som enten en væske eller fast med kun mindre ændringer, hvilket gør det ganske alsidigt.

For at demonstrere nytten af dette medie, skitserer vi en protokol for dets anvendelse for gonokok vækst og beskrive tre vellykkede eksperimenter til at karakterisere metal-lydhør Neisseria gener. For det første forbereder vi gonokok hele celle lysates fra metal-forarmet eller suppleret kulturer og demonstrere variable niveauer af proteinproduktion fra metal-responsive loci. Vi skitserer derefter en zink-begrænset vækst analyse, hvor gonokok vækst styres ved tilskud af specifikke, brugbare zink kilder. Endelig viser vi bindende analyser, der viser hele gonokokceller, der udtrykker metalresponsive overfladereceptorer, der binder sig til deres respektive metalholdige ligander. Vellykket overfladepræsentation af disse receptorer kræver vækst i metal-forarmet medium.

Den nuværende protokol blev optimeret specielt til Neisseria gonorrée, men mange andre bakterielle patogener anvender metal erhvervelse strategier under infektion⁷, så denne protokol kan tilpasses til studiet af metal homøostase i andre bakterier. Optimering af dette medie og disse eksperimentelle protokoller til brug i andre bakterier vil sandsynligvis kræve let ændring af metal chelator koncentrationer og / eller behandlingstid med Chelex-100, som andre bakterier kan have lidt forskellige metal krav end gonococcus. Jern og zink er de primære metaller, der giver anledning til bekymring i forbindelse med de beskrevne undersøgelser, men andre metaller (f.eks. mangan) er blevet påvist som kritiske for bakterier, herunder Neisseria^8,9,10,11,12. Desuden er lignende metoder blevet beskrevet for metal karakteriseringer i eukaryotiske celle kultur arbejde, som også kan overvejes. ^13.

Protocol

1. Udarbejdelse af Chelex-behandlede definerede medium (CDM) Stock Solutions Lagerløsning I Kombiner NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) og KH2PO4 (10,9 g) i deioniseret vand til en endelig volumen på 1 L. Filter steriliseropløsningen og aliquot i 50 ml koniske rør. Opbevares ved -20 °C. Aktieløsning II Kombiner thiamin HCl (0,2 g), thiamin py…

Representative Results

Et specifikt defineret medium i mangel af spormetaller til vækst af Neisseria gonorrée blev udviklet og implementeret til karakterisering af metal-responsive gener og deres genprodukter. I den optimerede protokol, metal profil af medier styres ved at tilføje metaller tilbage på skøn investigator, snarere end ved titreret kelation af et metal mål, giver mulighed for øget kontrol og konsistens fra lab til lab og eksperimentere for at eksperimentere. Dette medie kan anvendes …

Discussion

Vækstmedier tjener en række roller inden for mikrobiologisk forskning. Specialiserede medier bruges til udvælgelse, berigelse og forskellige andre applikationer til mange unikke typer af undersøgelse. En sådan anvendelse er induktion af metal-responsive gener, som typisk opnås ved tilsætning af en bestemt chelator, der er rettet mod en bestemt metal ion. Denne metode er begrænset, da mængden af kelation er nødvendig for forskellige spormetaller sandsynligvis vil være variabel på grund af forskellige vandkilde…

Materials

125 mL sidearm flasks	Bellco	2578-S0030	Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol	VWR	M131	Open in fume hood
3MM Paper	GE Health	3030-6461	Called "filter paper" in text
Agarose	Biolone	BIO-41025	Powder
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434	Powder
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501	Powder
Blotting grade blocker	Bio-Rad	170-6404	Nonfat dry milk
Bovine serum albumin	Roche	3116964001	Powder
Bovine transferrin	Sigma-Aldrich	T1428	Powder
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C5080	Powder
Calcium pantothenate	Sigma-Aldrich	C8731	Powder
Calprotectin	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin	Bio-Rad	142-2832	Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab	Puritan	25-806	Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine	Sigma-Aldrich	D9533	Powder
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Powder
Dialysis cassette	Thermo	66380	Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus	Schleicher & Schwell	10484138	Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol	Koptec	V1016	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	F7134	Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate	Sigma-Aldrich	F1143	Irritant, do not inhale
GC medium base	Difco	228950	Powder, already contains agar
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Powder
HEPES	Fisher	L-15694	Powder
Human transferrin	Sigma-Aldrich	T2030	Powder
Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	Powder
Klett colorimeter	Manostat	37012-0000	Uses color transmission to assess culture density
L-alanine	Sigma-Aldrich	A7627	Powder
L-arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Powder
L-asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A8381	Powder
L-aspartate	Sigma-Aldrich	A9256	Powder
L-cysteine hydrochloride	Sigma-Aldrich	C1276	Powder
L-cystine	Sigma-Aldrich	C8755	Powder
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	Powder
L-histidine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	H8125	Powder
L-isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752	Powder
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8000	Powder
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5501	Powder
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625	Powder
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126	Powder
L-proline	Sigma-Aldrich	P0380	Powder
L-serine	Sigma-Aldrich	S4500	Powder
L-threonine	Sigma-Aldrich	T8625	Powder
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254	Powder
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754	Powder
L-valine	Sigma-Aldrich	V0500	Powder
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Powder
Methanol	VWR	BDH1135-4LP	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose	GE Health	10600002	Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	60356	Powder
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Powder
Potassium sulfate	Sigma-Aldrich	P0772	Powder
Potato starch	Sigma-Aldrich	S4251	Powder
Reduced glutathione	Sigma-Aldrich	G4251	Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Powder
Sodium chloride	VWR	470302	Powder
Sodium citrate	Fisher	S279	Powder
Sodium hydroxide	Acros Organics	383040010	Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T4625	Powder
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Also called cocarboxylase
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	Powder
Tris	VWR	497	Powder
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750	Powder
Zinc sulfte heptahydrate	Sigma-Aldrich	204986	Irritant, do not inhale