Metallbegrenztes Wachstum von Neisseria gonorrhoeae für die Charakterisierung von metallresponsiven Genen und Metallakquise von Host Ligands

Summary

Wir beschreiben hier eine Methode für das Wachstum von Neisseria gonorrhoeae in metallbeschränkten flüssigen Medien, um die Expression von Genen für die Metallaufnahme zu erleichtern. Wir skizzieren auch nachgelagerte Experimente, um den Phänotyp von Gonokokken zu charakterisieren, die unter diesen Bedingungen angebaut werden. Diese Methoden können angepasst werden, um für die Charakterisierung von metallresponsiven Genen in anderen Bakterien geeignet zu sein.

Abstract

Spurenmetalle wie Eisen und Zink sind lebenswichtige Nährstoffe, die bekanntermaßen eine Schlüsselrolle in prokaryotischen Prozessen spielen, einschließlich Genregulation, Katalyse und Proteinstruktur. Die Metallsequestrierung durch Wirte führt oft zu Metallbeschränkungen für das Bakterium. Diese Einschränkung induziert bakterielle Genexpression, deren Proteinprodukte es Bakterien ermöglichen, ihre metallbegrenzte Umgebung zu überwinden. Die Charakterisierung solcher Gene ist eine Herausforderung. Bakterien müssen in sorgfältig vorbereiteten Medien angebaut werden, die einen ausreichenden Zugang zu Nährmetallen ermöglichen, um das Bakterienwachstum zu ermöglichen und gleichzeitig ein Metallprofil beizubehalten, das der Expression der oben genannten Gene förderlich ist. Daher muss ein empfindliches Gleichgewicht für die Konzentrationen dieser Metalle hergestellt werden. Der Anbau eines ernährungsphysiologisch bemittellichen Organismus wie Neisseria gonorrhoeae, der sich entwickelt hat, um nur im menschlichen Wirt zu überleben, fügt eine zusätzliche Komplexität hinzu. Hier beschreiben wir die Herstellung eines definierten metallbegrenzten Mediums, das ausreicht, um Gonokokkenwachstum und die gewünschte Genexpression zu ermöglichen. Diese Methode ermöglicht es dem Prüfer, Eisen und Zink aus unerwünschten Quellen zu chelatieren und gleichzeitig die Medien mit definierten Quellen von Eisen oder Zink zu ergänzen, deren Zubereitung ebenfalls beschrieben wird. Schließlich skizzieren wir drei Experimente, die diese Medien nutzen, um die Proteinprodukte metallregulierter Gonokokkengene zu charakterisieren.

Introduction

Neisseria gonorrhoeae verursacht die häufige sexuell übertragbare Infektion Gonorrhoe. Während der Infektion, pathogene Neisseria drücken ein Repertoire von metallreagierenden Genen, die die Bakterien ermöglichen, Metallrestriktionsbemühungen durch den menschlichen Wirt zu überwinden^1,2,3. Spurenmetalle wie Eisen und Zink spielen eine Schlüsselrolle in vielen zellulären Prozessen, wie die Bindung an Enzyme an katalytischen Stellen, die Teilnahme an Redoxreaktionen und als strukturelle Faktoren in verschiedenen Proteinen^4,5. Unter metallbegrenzten Bedingungen werden metallresponsive Loci ausgepresst und ihre resultierenden Proteine können den Erwerb dieser Nährstoffe unterstützen. Die Charakterisierung dieser Gene und Proteine stellt eine einzigartige technische Herausforderung für den Forscher dar. Metallionen müssen Bakterien vorenthalten werden, um die Transkription dieser Gene aus ihren nativen Loci zu induzieren, aber eine effektive Chelation dieser Ionen aus metallbeladenen Medien kann schwierig zu optimieren sein. Die verschiedenen Metallprofile von Quellwasser und inhärenten Los-zu-Los-Variation⁶ von pulverförmigen Zutaten bedeutet, dass die Menge an Chelat erforderlich, um ein bestimmtes Metall aus einem reichen Medium zu entfernen variiert zwischen verschiedenen Standorten, Zutaten Anbieter, und sogar im Laufe der Zeit innerhalb eines einzigen Labors als chemische Inventar ersetzt wird.

Um diese Herausforderung zu umgehen, beschreiben wir die Herstellung eines definierten Mediums, das während der Vorbereitung mit Chelex-100-Harz behandelt wird, um Spurenmetalle aus der Lösung zu entfernen. Dieses Medium ist ausreichend nährstoffreich, um das Wachstum von Gonokokken zu ermöglichen, die außerhalb des menschlichen Wirts schwer zu kultitochern ist, und ermöglicht es dem Prüfer, ein bestimmtes Metallprofil durch Addition eigener definierter Quellen und Konzentrationen von Metalle. Die Methode des kontrollierten Add-back von gewünschten Metallen zu erschöpftem Medium erhöht die experimentelle Konsistenz und ermöglicht robuste, reproduzierbare Experimente unabhängig von Faktoren wie Wasserquelle und chemischen Chargenzahlen. Darüber hinaus kann dieses Medium entweder als Flüssigkeit oder Feststoff mit nur geringfügigen Modifikationen eingesetzt werden, was es sehr vielseitig macht.

Um den Nutzen dieses Mediums zu demonstrieren, skizzieren wir ein Protokoll für seine Verwendung für gonokokken Wachstum und beschreiben drei erfolgreiche Experimente zur Charakterisierung metallempfindlicher Neisseria-Gene. Zunächst bereiten wir Gonokokken-Vollzelllysate aus metallenen oder ergänzten Kulturen vor und zeigen eine variable Proteinproduktion aus metallresponsiven Loci. Wir skizzieren dann einen zinkbeschränkten Wachstumstest, bei dem das Gonokokkenwachstum durch Supplementierung spezifischer, verwendbarer Zinkquellen gesteuert wird. Schließlich zeigen wir verbindliche Assays, die ganze Gonokokkenzellen zeigen, die metallresponsive Oberflächenrezeptoren exdrücken, die an ihre jeweiligen metallhaltigen Liganden binden. Eine erfolgreiche Oberflächendarstellung dieser Rezeptoren erfordert Wachstum in metallenen, erschöpften Medien.

Das vorliegende Protokoll wurde speziell für Neisseria gonorrhoeaeoptimiert, aber zahlreiche andere bakterielle Krankheitserreger verwenden Metallerfassungsstrategien während der Infektion⁷, so dass dieses Protokoll für die Untersuchung der Metallhomöostase bei anderen Bakterien angepasst werden kann. Die Optimierung dieser Medien und dieser experimentellen Protokolle für den Einsatz in anderen Bakterien erfordert wahrscheinlich eine leichte Änderung der Metallchelatorkonzentrationen und/oder Behandlungszeit mit Chelex-100, da andere Bakterien leicht andere Metallanforderungen als Gonococcus haben können. Eisen und Zink sind die Hauptmetalle, die für die beschriebenen Untersuchungen von Belang sind, aber andere Metalle (z. B. Mangan) wurden als kritisch für Bakterien nachgewiesen, einschließlich Neisseria^8,9,10,11,12. Darüber hinaus wurden ähnliche Methoden für Metallcharakterisierungen in der eukaryotischen Zellkulturarbeit beschrieben, die ebenfalls in Betracht gezogen werden können. ¹³

Protocol

1. Vorbereitung von Chelex-behandelten Defined Medium (CDM) Stock Solutions Lagerlösung I Kombinieren Sie NaCl (233,8 g), K2SO4 (40,0 g), NH4Cl (8,8 g), K2HPO4 (13,9 g) und KH2PO4 (10,9 g) in entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 L. Filter sterilisieren die Lösung und aliquot in 50 ml konische Rohre. Bei -20 °C lagern. Lagerlösung II Thiamin HCl (0,2 g), Thiaminp…

Representative Results

Ein spezifisches definiertes Medium in Ermangelung von Spurenmetallen für das Wachstum von Neisseria gonorrhoeae wurde entwickelt und für die Charakterisierung von metallresponsiven Genen und deren Genprodukten implementiert. Im optimierten Protokoll wird das Metallprofil von Medien durch Zugabe von Metallen nach Ermessen des Prüfers gesteuert, anstatt durch titrierte Chelatung eines Metallziels, was eine erhöhte Kontrolle und Konsistenz von Labor zu Labor und Experiment zum …

Discussion

Wachstumsmedien spielen eine Vielzahl von Rollen in der mikrobiologischen Forschung. Spezialisierte Medien werden für die Auswahl, Anreicherung und verschiedene andere Anwendungen für viele einzigartige Arten von Studien verwendet. Eine solche Anwendung ist die Induktion von metallresponsiven Genen, die in der Regel durch Zugabe eines bestimmten Chelators erreicht wird, der auf ein bestimmtes Metallion abzielt. Dieses Verfahren ist begrenzt, da die für verschiedene Spurenmetalle erforderliche Chelatmenge aufgrund unte…

Materials

125 mL sidearm flasks	Bellco	2578-S0030	Must be custom ordered
2-Mercaptoethanol	VWR	M131	Open in fume hood
3MM Paper	GE Health	3030-6461	Called "filter paper" in text
Agarose	Biolone	BIO-41025	Powder
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	A9434	Powder
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501	Powder
Blotting grade blocker	Bio-Rad	170-6404	Nonfat dry milk
Bovine serum albumin	Roche	3116964001	Powder
Bovine transferrin	Sigma-Aldrich	T1428	Powder
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C5080	Powder
Calcium pantothenate	Sigma-Aldrich	C8731	Powder
Calprotectin	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Chelex-100 Resin	Bio-Rad	142-2832	Wash with deionized water prior to use
Cotton-tipped sterile swab	Puritan	25-806	Cotton is better than polyester for this application
Deferoxamine	Sigma-Aldrich	D9533	Powder
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Powder
Dialysis cassette	Thermo	66380	Presoak in buffer prior to use
Dot blot apparatus	Schleicher & Schwell	10484138	Lock down lid as tightly as possible before sample loading
Ethanol	Koptec	V1016	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Ferric chloride	Sigma-Aldrich	F7134	Irritant, do not inhale
Ferric nitrate nonahydrate	Sigma-Aldrich	F1143	Irritant, do not inhale
GC medium base	Difco	228950	Powder, already contains agar
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Powder
HEPES	Fisher	L-15694	Powder
Human transferrin	Sigma-Aldrich	T2030	Powder
Hypoxanthine	Sigma-Aldrich	H9377	Powder
Klett colorimeter	Manostat	37012-0000	Uses color transmission to assess culture density
L-alanine	Sigma-Aldrich	A7627	Powder
L-arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Powder
L-asparagine monohydrate	Sigma-Aldrich	A8381	Powder
L-aspartate	Sigma-Aldrich	A9256	Powder
L-cysteine hydrochloride	Sigma-Aldrich	C1276	Powder
L-cystine	Sigma-Aldrich	C8755	Powder
L-glutamate	Sigma-Aldrich	G1251	Powder
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	Powder
L-histidine monohydrochloride	Sigma-Aldrich	H8125	Powder
L-isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752	Powder
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8000	Powder
L-lysine	Sigma-Aldrich	L5501	Powder
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625	Powder
L-phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126	Powder
L-proline	Sigma-Aldrich	P0380	Powder
L-serine	Sigma-Aldrich	S4500	Powder
L-threonine	Sigma-Aldrich	T8625	Powder
L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254	Powder
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754	Powder
L-valine	Sigma-Aldrich	V0500	Powder
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M7506	Powder
Methanol	VWR	BDH1135-4LP	Flammable liquid, store in flammables cabinet
Nitrocellulose	GE Health	10600002	Keep in protective sheath until use
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	60356	Powder
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P9791	Powder
Potassium sulfate	Sigma-Aldrich	P0772	Powder
Potato starch	Sigma-Aldrich	S4251	Powder
Reduced glutathione	Sigma-Aldrich	G4251	Handle carefully. Can oxidize easily.
S100A7	N/A	N/A	We are supplied with this by a collaborator
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761	Powder
Sodium chloride	VWR	470302	Powder
Sodium citrate	Fisher	S279	Powder
Sodium hydroxide	Acros Organics	383040010	Highly hygroscopic
Thiamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	T4625	Powder
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Also called cocarboxylase
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	Powder
Tris	VWR	497	Powder
Uracil	Sigma-Aldrich	U0750	Powder
Zinc sulfte heptahydrate	Sigma-Aldrich	204986	Irritant, do not inhale